核酸構造と核酸-タンパク質相互作用の本質的光親和性プローブとしてのチオヌクレオ塩基の研究

Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.

• A Favre
• C Saintomé
• J L Fourrey
• P Clivio
• P Laugâa

抄録

ここ数年、チオヌクレオ塩基は、折り畳まれたRNA分子の溶液中の構造をプローブしたり、複雑な核タンパク質の集合体の中で核酸内や核酸とタンパク質の間の接触を特定したりするための固有のフォトラベルとして広く利用されています。大腸菌tRNAに見られる4-チオウラシルやその非天然の近縁体である4-チオチミン、6-チオグアニン、6-メルカプトプリンなどのチオ残基は、320nmよりも長い波長で光を吸収し、選択的に光活性化することができます。合成または酵素による方法が確立されており、ほとんどの場合、構造的および生物学的特性が変更されていないRNA（DNA）鎖内にチオヌクレオチドをランダムにまたは部位特異的に組み込むことができます。トリプレット状態の高い光反応性（系間収率が1に近い）により、4-チオウラシルおよび4-チオチミン誘導体は、ピリミジン（特にチミン）だけでなくプリンに対しても高い光架橋能を示します。塩基やヌクレオチドの混合物やジヌクレオチド中で得られる光生成物の性質から、主な光化学的経路は、ピリミジンの5,6二重結合への励起C-S結合の(2 + 2)光付加反応であることが同定され、その構造が特徴づけられるチエタン中間体が得られた。チエタン中のこれらの結合の相互配向に応じて、その後の暗転位により、それぞれ5-4または6-4ビピリミジン光付加体が得られた。4-チオチミジンとアデノシンの間に形成されるユニークな光付加体の形成にも同様のメカニズムが関与しているようです。チミン由来のアクセプターのより高い反応性は、チミンメチル基からの水素の抽出、ラジカル再結合に続くメチレン結合したビピリミジンに至る追加の経路によって説明することができます。核酸鎖に挿入されたチオヌクレオシドの高い光架橋能は、リボソーム内でのRNA-RNA接触を調べるために用いられており、特に小型リボソームサブユニット全体でのmRNAの経路を解明することができます。mRNAのスプライス部位とU RNAとの機能的相互作用をスプライスソーム内で検出することができました。溶液中の小エンドヌクレオリックリボザイム内で得られた光クロスリンクの分析は、HDVリボザイムのための第三の折り畳まれた疑似結び目構造を導き、ハンマーヘッドリボザイムのYフォームの構築を可能にし、それは結晶で観察された構造と密接に一致していることが明らかになった。核酸に組み込まれたチオヌクレオシドは、それと接触したタンパク質のアミノ酸残基を効率よく架橋します。形成される光付加体の性質についてはほとんど知られていないにもかかわらず、このアプローチは、定義された核酸部位で相互作用するタンパク質成分の同定に広く利用されており、様々なシステム（レプリソーム、スプライソーム、転写複合体、リボソーム）に適用されています。

In the past few years thionucleobases have been extensively used as intrinsic photolabels to probe the structure in solution of folded RNA molecules and to identify contacts within nucleic acids and/or between nucleic acids and proteins, in complex nucleoprotein assemblies. These thio residues such as 4-thiouracil found in E. coli tRNA and its non-natural congeners 4-thiothymine, 6-thioguanine and 6-mercaptopurine absorb light at wavelengths longer than 320 nm and, thus, can be selectively photoactivated. Synthetic or enzymatic procedures have been established, allowing the random or site-specific incorporation of thionucleotide(s) within a RNA (DNA) chain which, in most cases, retains unaltered structural and biological properties. Owing to the high photoreactivity of their triplet state (intersystem yield close to unity), 4-thiouracil and 4-thiothymine derivatives exhibit a high photocrosslinking ability towards pyrimidines (particularly thymine) but also purines. From the nature of the photoproducts obtained in base or nucleotide mixtures and in dinucleotides, the main photochemical pathway was identified as a (2 + 2) photoaddition of the excited C-S bond onto the 5, 6 double bond of pyrimidines yielding thietane intermediates whose structure could be characterized. Depending on the mutual orientation of these bonds in the thietanes, their subsequent dark rearrangement yielded, respectively, either the 5-4 or 6-4 bipyrimidine photoadduct. A similar mechanism appears to be involved in the formation of the unique photoadduct formed between 4-thiothymidine and adenosine. The higher reactivity of thymine derived acceptors can be explained by an additional pathway which involves hydrogen abstraction from the thymine methyl group, followed by radical recombination, leading to methylene linked bipyrimidines. The high photocrosslinking potential of thionucleosides inserted in nucleic acid chains has been used to probe RNA-RNA contacts within the ribosome permitting, in particular, the elucidation of the path of mRNA throughout the small ribosomal subunit. Functional interactions between the mRNA spliced sites and U RNAs could be detected within the spliceosome. Analysis of the photocrosslinks obtained within small endonucleolytic ribozymes in solution led to a tertiary folded pseudo-knot structure for the HDV ribozyme and allowed the construction of a Y form of a hammerhead ribozyme, which revealed to be in close agreement with the structure observed in crystals. Thionucleosides incorporated in nucleic acids crosslink efficiently amino-acid residues of proteins in contact with them. Despite the fact that little is known about the nature of the photoadducts formed, this approach has been extensively used to identify protein components interacting at a defined nucleic acid site and applied to various systems (replisome, spliceosome, transcription complexes and ribosomes).