骨粗鬆症脛骨骨折ラットにおけるmiR-144-3pを介したlncRNA MALAT1の発現と牽引下におけるBMSCの骨形成分化に及ぼす影響

Expression of lncRNA MALAT1 through miR-144-3p in Osteoporotic Tibial Fracture Rats and Its Effect on Osteogenic Differentiation of BMSC under Traction.

抄録

目的:

骨粗鬆症（OP）脛骨骨折ラットにおけるlncRNA MALAT1およびmiR-144-3pの発現を調べ、それらのターゲティング関係および牽引下の骨髄間葉系幹細胞（BMSC）の骨形成分化に及ぼす影響を解析すること。

Objective: To investigate the expression of lncRNA MALAT1 and miR-144-3p in osteoporotic (OP) tibial fracture rats and analyze their targeting relationship and effects on the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) under traction.

研究方法:

OP脛骨骨折モデルを確立し、ラットをsham群とモデル群に分けた。これらのラットの脛骨組織を採取した。増殖良好な培養ラットのBMSCを購入し、si-MALAT1およびmiR-144-3p-mimicの導入の有無によりグループ分けを行った。各グループにおけるMALAT1およびmiR-144-3pの発現を検出した。バイオインフォマティクスサイトとダブルルシフェラーゼを用いて、MALAT1とmiR-144-3pのターゲティング関係を予測し、各成分の骨分化関連遺伝子（コラーゲンI、オステオカルシン（OCN）、オステオポンチン（OPN）、アルカリホスファターゼ（ALP））の発現を、ALP染色とAR染色を用いてBMSCカルシウムノジュールの形成状態を検出しました。

Methods: The OP tibial fracture model was established, and the rats were divided into a sham group and a model group. The tibial tissue of these rats was taken. BMSC of cultured rats with good growth was purchased and grouped according to the presence or absence of transfection of si-MALAT1 and miR-144-3p-mimic. The expression of MALAT1 and miR-144-3p in each group was detected. The bioinformatics website and double luciferase were used to predict the targeting relationship between MALAT1 and miR-144-3p and to detect the expression of genes related to bone differentiation (collagen I, osteocalcin (OCN), osteopontin (OPN), and alkaline phosphatase (ALP)) of each component, and ALP staining and AR staining were used to detect the formation of BMSC calcium nodules.

結果:

モデル群におけるALPおよびTRAPのレベルは、偽薬群よりも高かった（< 0.05）。qRT-PCRの結果、モデル群におけるMALAT1の相対発現レベルは偽薬群よりも高く、miR-144-3pの相対発現レベルは偽薬群よりも低かった（< 0.05）................................MALAT1はmiR-144-3pとターゲッティングの関係にある。qRT-PCRの結果、Tension-MSC群におけるMALAT1の相対発現量はMSC群よりも高く、miR-144-3pの相対発現量はMSC群よりも低かった（< 0.05）。si-MALAT1 群のコラーゲン I、OCN、OPN、ALP タンパク質の発現量は、si-NC 群より高かった ( < 0.05 )。ALP染色の結果、Si-MALAT1グループのBMSCsは、Si-NCグループのBMSCsよりも強い骨形成分化能と高いALP活性を有していた。AR染色の結果、Si-NC群と比較して、Si-MALAT1群の細胞の鉱化度は高く、カルシウム結節の数は多く、細胞はより深く染色された。miR-144-3p-ミミックグループのコラーゲンI、OCN、OPN、ALPタンパク質の発現はミミック-NCグループより高かった（ < 0.05 ）。ALP染色の結果、miR-144-3p-mimic群のBMSCsはmimic-NC群と比較して、強い骨形成分化能と高いALP活性を有することが明らかとなった。AR染色の結果、mimic-NC群と比較して、miR-144-3p-mimic群の細胞の鉱化度は高く、カルシウム結節の数は多く、細胞はより深く染色されることが明らかとなった。

Results: The levels of ALP and TRAP in the model group were higher than that in the sham group ( < 0.05). qRT-PCR results showed that the relative expression level of MALAT1 in the model group was higher than that in the sham group, and the relative expression level of miR-144-3p was lower than that in the sham group ( < 0.05). MALAT1 has a targeting relationship with miR-144-3p. qRT-PCR results showed that the relative expression level of MALAT1 in the tension-MSC group was higher than the MSC group, and the relative expression level of miR-144-3p was lower than the MSC group ( < 0.05). The expressions of collagen I, OCN, OPN, and ALP proteins in the si-MALAT1 group were higher than those of the si-NC group ( < 0.05). The results of ALP staining showed that BMSCs of the si-MALAT1 group had stronger osteogenic differentiation capacity and higher ALP activity than those of the si-NC group. The results of AR staining showed that compared with the si-NC group, the mineralization degree of cells in the si-MALAT1 group was higher, the number of calcium nodules was more, and the cells were more deeply stained. The expressions of collagen I, OCN, OPN, and ALP proteins in the miR-144-3p-mimic group were higher than the mimic-NC group ( < 0.05). ALP staining results showed that BMSCs in the miR-144-3p-mimic group had strong osteogenic differentiation capacity and high ALP activity compared with the mimic-NC group. The results of AR staining showed that, compared with the mimic-NC group, the mineralization degree of cells in the miR-144-3p-mimic group was higher, the number of calcium nodules was more and the cells were more deeply stained.

結論:

OP ラットの脛骨骨折モデルでは、MALAT1 の発現が上昇し、miR-144-3p の発現が下降していることが判明した。MALAT1 は miR-144-3p と標的関係にあり、MALAT1 のダウンレギュレーションと miR-144-3p のアップレギュレーションは、牽引下の BMSC の骨形成分化を促進する可能性があることがわかった。

Conclusion: In the OP rat model with the tibial fracture, the expression of MALAT1 is upregulated and that of miR-144-3p is downregulated. MALAT1 has a targeting relationship with miR-144-3p, and downregulation of MALAT1 and upregulation of miR-144-3p can promote the osteogenic differentiation of BMSC under traction.