ヒト唾液中の炎症性バイオマーカーおよび尿酸のクロマトグラフィーによる定量法

Chromatographic method for the determination of inflammatory biomarkers and uric acid in human saliva.

抄録

唾液中の免疫系活性化バイオマーカー、尿酸、クレアチニンの濃度測定は、悪性疾患、炎症性疾患、歯周病などの疾患の診断や初期症状のモニタリングに有用なツールとなる。我々は，ヒト唾液中のネオプテリン，トリプトファン，クレアチニン，尿酸，キヌレニンを分離・定量するために，蛍光およびダイオードアレイ検出器を組み合わせた高速液体クロマトグラフィー法を開発し，その妥当性を検証した。第二世代のモノリス固定相を用い，リン酸緩衝液で溶出することにより，9分以内にこれらの分析物の分離が達成された。本法は、少量のサンプルマトリックスを必要とする非常にシンプルなサンプル調製法である。また，内標準物質の3-ニトロ-l-チロシンを用いることで，より正確な定量が可能となりました。本法の感度は，定量下限がネオプテリンで0.6×10μmol/L，トリプトファンで0.725μmol/L，クレアチニンで0.12μmol/L，尿酸で0.18μmol/L，キヌレニンで0.135μmol/Lで実証されています。乳がん、卵巣がん、大腸がん、腎臓がんの患者から採取した実唾液67検体、歯周病患者の唾液19検体で本法を検証し、炎症反応をモニタリングすることができました。

Determination of concentration of biomarkers of the activation of immune system, uric acid, and creatinine in the saliva can be useful tool for the diagnosis and monitoring of early manifestations of diseases such as malignant, inflammatory, and periodontal disorders. We have developed and validated a high-performance liquid chromatographic method coupled with fluorescence and diode array detection for the separation and quantification of neopterin, tryptophan, creatinine, uric acid, and kynurenine in the human saliva. A separation of these analytes was achieved within 9 min by using second-generation monolithic stationary phase and elution with phosphate buffer. The present method involves very simple sample preparation requiring small amount of sample matrix. The internal standard 3-nitro-l-tyrosine was used for a more precise quantification. The sensitivity of the present method was demonstrated with lower limits of quantification of 0.6 × 10 μmol/L for neopterin, 0.725 μmol/L for tryptophan, 0.12 μmol/L for creatinine, 0.18 μmol/L for uric acid, and 0.135 μmol/L for kynurenine. The method was validated with 67 real-life saliva samples collected from patients suffering from breast, ovarian, colorectal, and renal cancer, and 19 saliva samples from patients with periodontal diseases and allowed monitoring of inflammatory response.