脱灰骨基質中の骨形成促進蛋白質2の含有量と骨形成活性との相関に関する研究

[Study on the correlation between the content of bone morphogenetic protein 2 in demineralized bone matrix and its osteogenic activity and ].

抄録

目的:

脱灰骨基質（DBM）中の骨形態形成蛋白質2（BMP-2）含量と骨形成活性との相関を調べ、DBMの骨形成活性を評価する簡便な方法を選択すること。

OBJECTIVE: To investigate the correlation between the content of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in demineralized bone matrix (DBM) and its osteogenic activity and , in order to choose a simple and convenient method to evaluate the osteogenic activity of DBM.

方法:

9名のドナーの左大腿中節組織を採取し、動的脱灰法によりDBM（S1-S9）を調製し、同時に不活化DBM（対照群）を調製した。プロテアーゼ阻害剤法、コラゲナーゼ法、塩酸グアニジン／四酢酸エチレンジアミン（EDTA）法、RIPA溶解液法を用いて、S1-S9および不活化DBM中のBMP-2を抽出した。BMP-2含量を測定し、DBM間の差を比較した。次に、S1-S9および不活性化DBMをそれぞれマウス胚性骨芽細胞MC3T3-E1と共培養した。細胞増殖はMTT法と蛍光染色で検出し、同時にアルカリホスファターゼ（ALP）活性を検出した。30匹のBALB/c雄性ヌードマウスをS1-S9 DBM群（S1-S9群）と不活化DBM群（対照群）の10群に分け、各群3匹ずつとした。各群のマウスの両後肢に中腿の筋ポケットを作製し、対応するDBM材料を移植した。術後4週目にサンプルを採取し、HE染色観察および半定量的評価を行い、新生骨形成スコアを算出した。

METHODS: The left mid-femoral tissues of 9 donors were taken, and DBMs (S1-S9) were prepared by dynamic decalcification process, and inactivated DBM (control group) was prepared at the same time. Protease inhibitor method, collagenase method, guanidine hydrochloride/ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) method, and RIPA lysate method were used to extract BMP-2 in S1-S9 and inactivated DBMs. The BMP-2 content was measured and the differences between DBMs were compared. Then the S1-S9 and inactivated DBMs were co-cultured with mouse embryonic osteoblasts MC3T3-E1, respectively. The cell proliferation was detected by MTT method and fluorescence staining, and alkaline phosphatase (ALP) activity was detected at the same time. Thirty BALB/c male nude mice were divided into 10 groups, namely S1-S9 DBM groups (S1-S9 groups) and inactivated DBM group (control group), with 3 mice in each group. Muscle pockets of the middle thighs were prepared on both hindlimbs of mice in each group, and implanted corresponding DBM materials. At 4 weeks after operation, the samples were taken for HE staining observation and semi-quantitative evaluation, and the new bone formation score was calculated.

結果:

異なるドナー骨由来のDBMのBMP-2含量は異なっていた。また、同じドナー骨から調製したDBMでも、抽出方法の違いによって得られるBMP-2含量は異なり、塩酸グアニジン/EDTA法の抽出効率が最も高かった。細胞実験では、MTT試験により、共培養後の各時点で、S4およびS6群の細胞増殖およびALP活性が他の群よりも有意に高いことが示された（<0.05）。さらに、S4群の細胞増殖は7日目で最も顕著であった（<0.05）。蛍光染色により、各群の骨芽細胞は良好な状態であったが、S1、S2、S3、S4、S6群の骨芽細胞は他の群より有意に多かった。 異所性骨形成実験では、術後4週目のS1～S6群の骨移植部に軟骨と新生骨の形成が認められ、BMP-2含量の増加に伴い、材料によって誘導される新生骨形成のスコアが高くなった（＜0.05）。中でも、S4群とS6群では、骨形成領域に軟骨細胞と骨芽細胞が多く含まれていた。

RESULTS: The BMP-2 content of DBM derived from different donor bones was distinct. The BMP-2 content obtained by different extraction methods for DBM prepared from the same donor bone was also different, and the extraction efficiency of the guanidine hydrochloride/EDTA method was the highest. cell experiments, MTT test displayed that cell proliferations and ALP activity were significantly higher in S4 and S6 groups than in other groups at each time point after co-cultivation ( <0.05). Moreover, the cell proliferation of S4 group was the most significant at 7 days ( <0.05); fluorescence staining demonstrated that the osteoblasts of each group was in good condition, but the osteoblasts of S1, S2, S3, S4, and S6 groups were significantly more than other groups. ectopic osteogenesis experiments, the cartilage and new bone formation could be seen in the bone graft area of S1-S6 groups at 4 weeks after operation, and with the increase of BMP-2 content, the more new bone formation induced by the material, the higher the score of new bone formation of the material ( <0.05). Among them, S4 and S6 groups contained a large number of chondrocytes and osteoblasts in the osteogenesis area.

結論:

DBMの骨形成活性は、BMP-2の定量的検出と骨芽細胞の増殖・分化実験を組み合わせることで評価できる。

CONCLUSION: The osteogenic activity of DBM can be evaluated through BMP-2 quantitative detection combined with osteoblast proliferation and differentiation experiments.

目的:

探讨脱钙骨基质（脱灰骨基質，DBM）中 BMP-2 含量与其体内/外成骨活性的相关性，以期选择一种简易，.便捷的评价 dbm 成骨活性的方法。

目的: 探讨脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）中 BMP-2 含量与其体内/外成骨活性的相关性，以期选择一种简易、便捷的评价 DBM 成骨活性的方法。.

方法:

取 9 具人尸体左侧股骨中段组织，。采用动态脱钙工艺制备dbm（s1～s9）同时制备灭活dbm（对照）。采用蛋白酶抑制剂法、胶原酶法、?盐酸胍/荏田法、裂解液法提取S1～S9 以及灭活dbm中bmp-2，测量比较不同dbm间bmp-2 含量差异。s1～s9 以及灭活dbm，分别与小鼠胚胎成骨细胞 mc3t3-e1 共培养采用mtt 法及𝑛光染色检测细胞增。殖，同时检测 ALP 活性。裸小鼠分为 10 组，分别为 s1～s9 dbm 组（s1～s9 组）以及灭活dbm 组（对照组，每组 3 只于各组小鼠双侧后肢大腿中部制备肌袋，植入对应dbm 材料，术后 4 周取材行彼 染色观察并半定量评价（新骨形成评分）。

方法: 取 9 具人尸体左侧股骨中段组织，采用动态脱钙工艺制备 DBM（S1～S9），同时制备灭活 DBM（对照）。分别采用蛋白酶抑制剂法、胶原酶法、盐酸胍/EDTA 法、RIPA 裂解液法提取 S1～S9 以及灭活 DBM 中 BMP-2，测量比较不同 DBM 间 BMP-2 含量差异。取 S1～S9 以及灭活 DBM，分别与小鼠胚胎成骨细胞 MC3T3-E1 共培养，采用 MTT 法及荧光染色检测细胞增殖，同时检测 ALP 活性。取 30 只 BALB/c 雄性裸小鼠分为 10 组，分别为 S1～S9 DBM 组（S1～S9 组）以及灭活 DBM 组（对照组），每组 3 只。于各组小鼠双侧后肢大腿中部制备肌袋，植入对应 DBM 材料，术后 4 周取材行 HE 染色观察并半定量评价（新骨形成评分）。.

结果:

不同供体骨制备的dbm，其bmp-2 含量存在差异；同一供体骨制备的dbm，经不同提取方法获得的bmp-2 含量也不同，其中瘅D0↩酸胍/edta 法提取效率最高。时间点 s4、s6 组细胞增殖、alp 活性均较其他组明显增高（<0.05），且 7 d 时 S4 组细胞增殖最显著（<0.05）；毫毫染色示各组成骨细胞状态均良好，但s1，s2，s3，s4，。s6 组成骨细胞多于其他组成，体内异位成骨诱导实验示，术后4周 s1～s6 组植骨区域均见软骨和新骨生成，并且随着bmp-2 含有量增加，材料诱导新骨生成越多，新骨形成评分较高（<0.05）；其中s4、s6组骨新生区域含有大量软骨细胞和成骨细胞。

结果: 不同供体骨制备的 DBM，其 BMP-2 含量存在差异；同一供体骨制备的 DBM，经不同提取方法获得的 BMP-2 含量也不同，其中盐酸胍/EDTA 法提取效率最高。体外成骨性能评价，共培养后各时间点 S4、S6 组细胞增殖、ALP 活性均较其他组明显增高（ <0.05），且 7 d 时 S4 组细胞增殖最显著（ <0.05）；荧光染色示各组成骨细胞状态均良好，但 S1、S2、S3、S4、S6 组成骨细胞多于其他组。体内异位成骨诱导实验示，术后 4 周 S1～S6 组植骨区域均可见软骨和新骨生成，并且随着 BMP-2 含量增加，材料诱导新骨生成越多，新骨形成评分较高（ <0.05）；其中 S4、S6 组骨新生区域含有大量软骨细胞和成骨细胞。.

结论:

bmp-2 定量检测结合体外成骨细胞增殖实验可用于评估dbm成骨活性。

结论: BMP-2 定量检测结合体外成骨细胞增殖分化实验可用于评估 DBM 成骨活性。.