Pfr-favoured Variantsの検索におけるフィトクロム光化学の迅速なスクリーニングと特性評価のための分光学に基づく方法論

A Spectroscopy-based Methodology for Rapid Screening and Characterization of Phytochrome Photochemistry in Search of Pfr-favoured Variants.

• Giuliano Tomás Antelo
• Maximiliano Sánchez-Lamas
• Fernando Alberto Goldbaum
• Lisandro Horacio Otero
• Hernán Ruy Bonomi
• Jimena Rinaldi

抄録

フィトクロムは、共有結合した開鎖発色団を持つ感光性タンパク質で、赤色光を吸収するPrと遠赤色光を吸収するPfrの2つの主要な状態を切り替えることができます。私たちのグループはこれまでに、Xanthomonas campestris pv. campestris由来のバクテリオフィトクローム（XccBphP）が、ビリベルジンIXαをコファクターとするバティライクなフィトクロームであり、細菌の病原性に関与していることを明らかにしてきました。これまでのところ、XccBphPの結晶構造はPr状態でしか解けず、Pfr状態の構造は不明でした。本研究の目的は、迅速な特性評価のための効率的なスクリーニング方法を開発し、Pfr状態を好むXccBphPの変異体を同定することであった。ここで開発されたスクリーニング手法は、組換え植物クロムを含む清澄化粗抽出物のUV-Vis吸収挙動を分析することで構成されています。この戦略により、100以上のXccBphPの変異体を迅速に探索し、複数の変異体を特徴付け、Pfrを好む候補を同定することができました。得られた高品質のデータにより、光化学の定性だけでなく定量的な特性評価も可能になりました。この方法は、他の植物クロムや他の光受容体ファミリーにも容易に適応できる。

Phytochromes are photosensitive proteins with a covalently bound open-chain chromophore that can switch between two principal states: red-light absorbing Pr and far-red light absorbing Pfr. Our group has previously shown that the bacteriophytochrome from Xanthomonas campestris pv. campestris (XccBphP) is a bathy-like phytochrome that uses biliverdin IXα as a co-factor and is involved in bacterial virulence. To date, the XccBphP crystal structure could only be solved in the Pr state, while the structure of its Pfr state remains elusive. The aims of this work were to develop an efficient screening methodology for the rapid characterization and to identify XccBphP variants that favour the Pfr form. The screening approach developed here consists in analyzing the UV-Vis absorption behaviour of clarified crude extracts containing recombinant phytochromes. This strategy has allowed us to quickly explore over a hundred XccBphP variants, characterize multiple variants and identify Pfr-favoured candidates. The high-quality data obtained enabled not only a qualitative, but also a quantitative characterization of their photochemistry. This method could be easily adapted to other phytochromes or other photoreceptor families.

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