Geobacillus stearothermophilus由来L-アラビノースイソメラーゼの酸性条件下での活性向上のための発現と特性評価

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Protein Expr. Purif..2020 Jul;:105692. S1046-5928(20)30283-7. doi: 10.1016/j.pep.2020.105692.Epub 2020-07-15.

Geobacillus stearothermophilus由来L-アラビノースイソメラーゼの酸性条件下での活性向上のための発現と特性評価

Expression and characterization of L-arabinose isomerase from Geobacillus stearothermophilus for improved activity under acidic condition.

Fina Amreta Laksmi
Shigeki Arai
Tsutomu Arakawa
Hirohito Tsurumaru
Yoshitaka Nakamura
Budi Saksono
Masao Tokunaga
Matsujiro Ishibashi

PMID: 32681957 DOI: 10.1016/j.pep.2020.105692.

抄録

低カロリーの糖代替甘味料であるＤ-タガトースは、基質であるＤ-ガラクトースからＬ-アラビノース異性化酵素（Ｌ-ＡＩ）によって製造することができる。しかし、このプロセスはアルカリ性のpHや高温で行うとメイラード反応を起こす。このため、工業的に利用するには、メイラード反応を最小限に抑えるために、微酸性条件下での反応が望ましい。これまでに、より基質特異性の高い Geobacillus stearothermophilus から L-AI の変異体 H18T を得た。H18T は優れた耐熱性を有するが、酸性条件下での活性は最適ではなかった。ここで、H18Tの結合ポケット領域周辺のPCRを用いたランダム変異誘発法により、pH6.0で活性が向上したH18Tタンパク質の潜在的変異体であるH18T-Y234Cを得ることに成功した。この二重H18T-Y234C変異体は、親H18T及び野生型と比較して、pH6.0で1.8倍、3倍の活性を有し、最適pH範囲を6.0-8.0に拡大した。残基234のTyrからCysへの変異は、L-AIの二次構造にほとんど影響を与えなかった。また、ジスルフィド結合の形成も検出されなかった。このことから、pH6.0での活性向上は、残基234の結合ポケット領域の変化によるものと考えられた。本研究は、酸性条件下での活性向上における残基234の重要性を示唆するものである。

A low-calorie sugar-substituting sweetener, D-tagatose, can be produced by L-arabinose isomerase (L-AI) from the substrate D-galactose. However, this process suffers from a Maillard reaction when performed at alkaline pH and high temperature. For industrial applications, therefore, a reaction under slightly acidic conditions is desirable to minimize the Maillard reaction. Previously, we obtained a mutant of L-AI, H18T, from Geobacillus stearothermophilus with greater substrate specificity. Although H18T possessed excellent thermostability, its activity under acidic conditions was not optimal. Here, we successfully obtained a potential variant of the H18T protein, H18T-Y234C, which achieved improved activity at pH 6.0, based on random mutagenesis using error-prone PCR around the binding pocket area of H18T. This double H18T-Y234C mutant possessed 1.8-fold and 3-fold higher activity at pH 6.0 than the parent H18T and the wild type, thereby broadening the optimal pH range to 6.0-8.0. Mutation from Tyr to Cys at residue 234 had little effect on the secondary structure of L-AI. Furthermore, the formation of disulfide bonds was not detected. Thus, the improvement of activity at pH 6.0 is probably caused by the change in the binding pocket area involving residue 234. This study offers insight into the importance of residue 234 in improving the activity under acidic conditions.