HPLCを用いたラット血漿および脳ホモジネート中のγ-オリザノールの推定のための新しいバイオ分析技術

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Ann Pharm Fr.2020 Jul;S0003-4509(20)30083-3. doi: 10.1016/j.pharma.2020.07.003.Epub 2020-07-15.

HPLCを用いたラット血漿および脳ホモジネート中のγ-オリザノールの推定のための新しいバイオ分析技術

Novel bio-analytical technique for estimation of gamma oryzanol in rat plasma and brain homogenate using HPLC.

Sumit Singh
Charmy Kothari
Patel Misari
Shital Panchal

PMID: 32681901 DOI: 10.1016/j.pharma.2020.07.003.

抄録

米ぬか油の成分であるγ-オリザノールは、抗がん作用や抗高脂血症作用があることから使用されている。ラット血漿および脳ホモジネートの生物分析法は、PDA検出器を備えたHPLCシステムを用いて開発され、C-18カラム（4.6 mm x 150 cm, 5μ）を用いて、移動相としてメタノール：アセトニトリル（65:35, v/v）、1.2 ml/minの流速で1%酢酸を溶出し、326 nmの波長で検出した。血漿および脳ホモジネートからオリザノールを抽出する際には、回収率が最も高い（血漿95％、脳ホモジネート85％）ことから液体抽出法を選択した。各体液について様々な抽出溶媒を分析しましたが、その中でも血漿（95％）の回収率が最も高かったのはアセトンでした。血漿（95%）はアセトン：IPA（1:1、v/v）で、脳ホモジネート（85%）はイソプロピルアルコール（IPA）で最も高い回収率が観察された。直線性は500 ng/mL-5000 ng/mLであった。日間および日内精度（％RSD）は10％以下、精度は±5％であった。選択性とマトリックス効果が確認され、USFDAの基準に従っていることが確認されました。血漿サンプルは分析期間にわたって安定していることが判明し、HQCサンプルは凍結融解安定性において第3サイクルまで安定していましたが、LQCサンプルは第4サイクルまで安定していました。この方法はシンプルで有用であり、前臨床研究や実験研究に適していることが証明された。

Gamma oryzanol, a component of rice bran oil is used for its anticancer and antihyperlipidemic properties. Bioanalytical method for rat plasma and brain homogenate was developed by HPLC system with a PDA detector in which drug elution was performed using C-18 column (4.6 mm x 150 cm, 5µ) with 1% acetic acid in methanol: acetonitrile (65:35, v/v) as mobile phase at 1.2 ml/min flow rate and detected at 326 nm wavelength. Liquid liquid extraction method was chosen for extraction of oryzanol from plasma as well as brain homogenate as it provided highest recovery (95% in plasma, 85% in brain homogenate). Various extraction solvents for each body fluid were analysed, out of which highest recovery for plasma (95 %), in acetone: IPA (1:1, v/v) and for brain homogenate (85 %) in isopropyl alcohol (IPA) was observed. Observed linearity was between 500 ng/mL- 5000 ng/mL. The interday and intraday precision (i.e. %RSD) was less than 10% and accuracy was ± 5%.. Selectivity and matrix effect was checked and found as per USFDA criteria. Plasma samples were found to be stable over the analysis period, HQC samples were stable up to third cycle in freeze and thaw stability while LQC samples were stable over fourth cycle. The method proved to be simple, useful and is appropriate, for preclinical and experimental research.