唾液性エクソソソームのタンパク質の包括的な分析と比較

Comprehensive analysis and comparison of proteins in salivary exosomes of climacteric and adolescent females.

• Akane Imai
• Shunya Oka
• Mio Susuga
• Noriko Tsutsui
• Maiko Haga-Tsujimura
• Eiichi Saitoh

抄録

現在、唾液から安定した物理化学的特性を有するエクソソームを抽出することは困難である。また、基礎データが十分に入手できないため、診断材料としての唾液エクソソームの応用は限られている。本研究では、唾液全体からエクソソソームを抽出するための簡便な方法を検討し、2つの年齢層の被験者から得られた唾液エクソソーム中のタンパク質を比較した。女性9名（56.7±1.17歳；乳腺期、19.9±0.20歳；思春期）から市販の試薬とキットを用いて唾液エクソソームを抽出し、抗エクソソームマーカー抗体を用いたウエスタンブロッティングで検出した。エクソソソーム粒子径はNanoSight、エクソソーム含有タンパク質は液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いてそれぞれ同定した。また、超遠心機を使用せずに試薬を用いて唾液からエキソソームを効率的に抽出する方法を示した。その結果、青年期エクソソソームに比べて乳酸菌エクソソームの方が総タンパク質含量が高く、粒子径が大きいことが明らかになった。思春期エクソソソームでは、乳酸菌エクソソソーム（573 個）に比べてタンパク質の種類が多く（780 個）、全体では 893 個のタンパク質が含まれていた。唾液性エクソソソームでは、合計で893個のタンパク質が同定された。ウイルスのプロセス、リボソーム、構造分子関連のタンパク質は思春期エクソソソームで高かったが、免疫グロブリンやアミラーゼなどの主要な唾液性タンパク質のレベルは思春期エクソソソームよりも乳酸性エクソソソームの方が高かった。唾液性エキソソームの基本的なタンパク質組成と加齢に伴う変化を示す発表されたデータは、診断とバイオテクノロジーの両方のアプリケーションに有益です。

Currently, it is difficult to extract exosomes with stable physicochemical properties from saliva. Furthermore, due to inadequate availability of basic data, the application of salivary exosomes as a diagnostic material is limited. In this study, we aimed to investigate an easier method for extraction of exosomes from whole saliva and compared proteins in salivary exosomes derived from subjects of two age groups. Salivary exosomes were extracted from nine females (56.7 ± 1.17 years old; climacteric or 19.9 ± 0.20 years old; adolescent) using commercial reagents and kits and detected using western blotting with anti-exosome marker antibodies. Exosome particle size and exosome-containing proteins were identified using NanoSight and liquid chromatography with tandem mass spectrometry, respectively. In addition, an efficient method of exosome extraction from saliva using a reagent and without the use of an ultracentrifuge was shown. Our results showed a higher total protein content and larger particle size in climacteric exosomes than in adolescent exosomes. However, adolescent exosomes showed a larger variety of proteins (780 proteins) than the climacteric exosomes (573 proteins). Altogether, 893 proteins were identified in the salivary exosomes. Although viral process-, ribosome- and structural molecule-related proteins were higher in the adolescent exosomes, the levels of major salivary proteins such as immunoglobulins and amylase, were higher in the climacteric exosomes than in the adolescent exosomes. The data presented, which show the fundamental protein composition of salivary exosomes and the changes that occur with age, are beneficial in both diagnostic and biotechnological applications.