ハプロイドカンジダ種におけるゲノムワイドなpiggyBacトランスポゾンベースの突然変異誘発と定量的挿入部位解析

Genome-wide piggyBac transposon-based mutagenesis and quantitative insertion-site analysis in haploid Candida species.

• Zeyao Li
• Haitao Wang
• Chunling Cai
• Ada Hang-Heng Wong
• Jianbin Wang
• Jiaxin Gao
• Yue Wang

抄録

カンジダ種による侵略的真菌感染症は、高い死亡率を伴う生命を脅かすものであり、深刻な公衆衛生上の脅威となっています。病原性遺伝子や治療標的をゲノムワイドに迅速に同定するための新しい技術が急務となっています。最近、ハプロイドCandida albicansにおけるpiggyBac（PB）トランスポゾン媒介突然変異誘発システムを工学的に構築したことにより、他のハプロイドCandida種にも適応可能な強力な発見ツールを提供することができた。本プロトコルでは、ハプロイドC. albicansを例に、突然変異誘発システムの改良版を提示し、高品質の突然変異ライブラリーを構築するためのプロトコルの詳細な説明を提供する。また、定量的なPB挿入部位配列決定法であるPBISeqについても記述する。PBISeqライブラリ作成手順は、タグ付けを利用して迅速かつ効率的にシーケンシングライブラリを構築することができる。最後に、我々が設計したハプロイドC. albicans株のde novoアセンブルゲノム中のPB挿入部位を解析するためのパイプラインを紹介する。転座誘導から最終的なライブラリーを作成し、配列決定の準備が整うまでに約7日間を要します。このプロトコルは、他のアプローチに比べて非常に効率的で労力が少なく、カンジダの遺伝学的研究を大幅に加速させることができます。

Invasive fungal infections caused by Candida species are life threatening with high mortality, posing a severe public health threat. New technologies for rapid, genome-wide identification of virulence genes and therapeutic targets are urgently needed. Our recent engineering of a piggyBac (PB) transposon-mediated mutagenesis system in haploid Candida albicans provides a powerful discovery tool, which we anticipate should be adaptable to other haploid Candida species. In this protocol, we use haploid C. albicans as an example to present an improved version of the mutagenesis system and provide a detailed description of the protocol for constructing high-quality mutant libraries. We also describe a method for quantitative PB insertion site sequencing, PBISeq. The PBISeq library preparation procedure exploits tagmentation to quickly and efficiently construct sequencing libraries. Finally, we present a pipeline to analyze PB insertion sites in a de novo assembled genome of our engineered haploid C. albicans strain. The entire protocol takes ~7 d from transposition induction to having a final library ready for sequencing. This protocol is highly efficient and less labor intensive than alternative approaches and significantly accelerates genetic studies of Candida.