磁気浮上法に基づく非付着型バイオフィルム様細菌凝集体の新しいin vitroモデル

A new in vitro model of non-attached biofilm-like bacterial aggregates based on magnetic levitation.

• Pavel Domnin
• Anastasiya Arkhipova
• Stanislav Petrov
• Elena Sysolyatina
• Vladislav Parfenov
• Pavel Karalkin
• Andrey Mukhachev
• Alexey Gusarov
• Mikhail Moisenovich
• Yusef Khesuani
• Svetlana Ermolaeva

抄録

慢性感染症は、非付着型バイオフィルム様凝集体の形成と関連している。表面に付着したバイオフィルムのin vitroモデルは、必ずしもこれらのプロセスを正確に模倣しているとは限らない。ここでは、磁場勾配の中に置かれた生物学的物体の磁気浮上の原理を用いて、in vitroで非付着細菌の凝集体を作製する新しいアプローチを試験した。磁気浮上条件下で生育した細菌は非付着性の凝集体を形成し、CLSMおよびSEMを用いて研究し、定量的に特徴付けた。非粘着性凝集体は細胞外マトリックスに浸漬した細菌からなり、ルビーレッドやコンゴレッド色素を結合する高分子マトリックス、細菌の増殖の前提条件、ゲンタマイシンに対する抵抗性の増加など、バイオフィルムに特徴的な特徴を示した。非付着性の凝集体を形成する菌株特異的な可能性を特徴づけるために、幾何学的サイズ、凝集体と自由遊泳菌の相対量、およびコンゴ赤の結合という3つの定量的手法を検討した。3つの菌株を比較した結果、非付着性凝集体を形成する菌株は凝集体を形成する菌株とは異なることが示された（p＜0.05）。さらに、これらの菌株によるプラスチック表面や寒天表面でのバイオフィルム形成を特徴づけたところ、バイオフィルム形成能が良好であることは必ずしも非付着性凝集体形成能が良好であるとは限らず、その逆もまた然りであることがわかった。非付着性細菌凝集体が慢性疾患の病態に果たす役割の理解を深めることが重要であることから、本モデルおよび定量法は、非付着性凝集体のin vitro研究や慢性感染症における細菌行動のモデル化に応用することができる。これらの凝集体は、生体液の体積内で低せん断条件下で形成され、表面に付着しないことから、バイオフィルムとは異なる。ここでは、磁気浮上による液体体積内での非付着凝集体形成を提供するin vitroモデルを記述する。このモデルを用いて、非付着凝集体とバイオフィルムの形態学的および機能的な類似性にもかかわらず、良好なバイオフィルム形成を示す菌株は非付着凝集体の形成不良を示す可能性があり、バイオフィルムと非付着凝集体の形成の基礎となるメカニズムは同一ではないことを示唆していることを実証した。磁気浮上法は、非付着凝集体形成のin vitro研究や慢性感染症における細菌の挙動のシミュレーションに有用である。

Chronic infections are associated with the formation of non-attached biofilm-like aggregates. In vitro models of surface-attached biofilms do not always accurately mimic these processes. Here, we tested a new approach to create in vitro non-attached bacterial aggregates using the principle of magnetic levitation of biological objects placed into a magnetic field gradient. Bacteria grown under magnetic levitation conditions formed non-attached aggregates that were studied with CLSM and SEM and characterized quantitatively. Non-attached aggregates consisted of bacteria submerged into an extracellular matrix and demonstrated features characteristic of biofilms, such as polymeric matrix that binds Ruby Red and Congo red dyes, prerequisite of bacterial growth, and increased resistance to gentamicin. Three quantitative methods were explored to characterize strain-specific potential to form non-attached aggregates: geometric sizes, relative quantities of aggregated and free-swimming bacteria, and Congo red binding. A comparison of three strains demonstrated that the strain weakly forming non-attached aggregates differed from strains that formed aggregates based on all three parameters (p<0.05). Further, we characterized biofilm formation on plastic and agar surfaces by these strains and found that good biofilm formation ability does not necessarily indicate good non-attached aggregate formation ability, and vice versa. The model and quantitative methods can be applied for in vitro studies of non-attached aggregates and modeling bacterial behavior in chronic infections, as it is important to increase understanding of the role that non-attached bacterial aggregates play in the pathogenesis of chronic diseases.An increasing amount of evidence indicates that chronic infections are associated with non-attached biofilm-like aggregates formed by pathogenic bacteria. These aggregates differ from biofilms because they form under low-shear conditions within the volume of biological fluids and they do not attach to surfaces. Here, we describe an in vitro model that provides non-attached aggregate formation within the liquid volume due to magnetic levitation. Using this model, we demonstrated that despite morphological and functional similarities of non-attached aggregates and biofilms, strains that exhibit good biofilm formation might exhibit poor non-attached aggregate formation, suggesting that mechanisms underlying the formation of biofilms and non-attached aggregates are not identical. The magnetic levitation approach can be useful for in vitro studies of non-attached aggregate formation and simulation of bacterial behavior in chronic infections.

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