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猛禽類におけるヘモスポリジウム寄生虫の絶対定量のための新しいプロトコル、および現在のアッセイとの比較
A new protocol for absolute quantification of haemosporidian parasites in raptors and comparison with current assays.
PMID: 32680557 DOI: 10.1186/s13071-020-04195-y.
抄録
背景:
感染強度の正確な定量化は、宿主-寄生虫関連の進化を理解するために、鳥類ヘモスポリジウム寄生虫の感染パターンを推定するために不可欠である。従来の顕微鏡法は費用対効果が高いが、高品質の血液塗抹と相当な経験を必要とする一方で、広く用いられている半定量的なqPCR法は、ほとんどが理想的な実験室ベースの黄金サンプルと標準曲線を使用しているため、異なる実験室からの寄生虫の比較が制限される可能性がある。
BACKGROUND: Accurate quantification of infection intensity is essential to estimate infection patterns of avian haemosporidian parasites in order to understand the evolution of host-parasite associations. Traditional microscopy is cost-effective but requires high-quality blood smears and considerable experience, while the widely used semi-quantitative qPCR methods are mostly employed with ideal, laboratory-based golden samples and standard curves, which may limit the comparison of parasitemia from different laboratories.
方法:
ここでは、猛禽類における鳥類ヘモスポリジアンの絶対定量のためのデジタルドロップレットPCR（ddPCR）プロトコルを提示します。新しいプライマーは、寄生虫のミトコンドリアゲノムの rRNA 領域の保存されたフラグメントを標的とするように設計されました。感度と再現性をqPCRや他のアッセイと比較して評価した。
METHODS: Here we present a digital droplet PCR (ddPCR) protocol for absolute quantification of avian haemosporidians in raptors. Novel primers were designed that target a conserved fragment of a rRNA region of the mitochondrial genome of the parasites. Sensitivity and repeatability were evaluated compared to qPCR and other assays.
結果:
このddPCRアッセイは、標準曲線を使用することなく、最小感染量10（すなわち、10個の宿主ゲノムに1個の寄生虫コピー）で、Plasmodium、Haemoproteus、およびLeucocytozoonに属するヘモスポリジウム寄生虫の正確な定量を可能にします。ddPCR によって評価された量は、低強度サンプルにおける非特異的増幅を減少させることにより、同じプライマーを使用した qPCR よりも正確であった。ddPCR 法は，特に感染強度が低い場合には，技術的な重複や反応の一貫性が高く，広く用いられている qPCR アッセイと比較して，同等の感度と高い対応性（R=0.97）を示した．また，鳥類ヘモスポリジアンのバーコード化に用いられているcytb遺伝子については，ddPCRおよびqPCRともに標準的なネストPCRプロトコールよりも多くの陽性サンプルを同定した．
RESULTS: This ddPCR assay enables accurate quantification of haemosporidian parasites belonging to Plasmodium, Haemoproteus and Leucocytozoon with minimum infection quantities of 10 (i.e. one parasite copy in 10 host genomes) without the use of standard curves. Quantities assessed by ddPCR were more accurate than qPCR using the same primers through reduction of non-specific amplification in low-intensity samples. The ddPCR technique was more consistent among technical duplicates and reactions, especially when infection intensities were low, and this technique demonstrated equal sensitivity with high correspondence (R = 0.97) compared to the widely used qPCR assay. Both ddPCR and qPCR identified more positive samples than the standard nested PCR protocol for the cytb gene used for barcoding avian haemosporidians.
結論:
我々は、鳥類ヘモスポリジアンの正確な定量を可能にする新規な ddPCR アッセイを開発した。このアッセイは、異なる宿主-寄生虫群における感染パターンを調査するための堅牢な方法として使用することができ、異なる研究室からの結果の比較を容易にすることができる。
CONCLUSIONS: We developed a novel ddPCR assay enabling accurate quantification of avian haemosporidians without golden samples or standard curves. This assay can be used as a robust method for investigating infection patterns in different host-parasite assemblages and can facilitate the comparison of results from different laboratories.