日本語AIでPubMedを検索
Monilinia vaccinii-corymbosi感染野生ブルーベリー表現型からの遺伝子発現研究のための信頼性の高い参照遺伝子の選択と検証
Selection and validation of reliable reference genes for gene expression studies from Monilinia vaccinii-corymbosi infected wild blueberry phenotypes.
PMID: 32678232 PMCID: PMC7366731. DOI: 10.1038/s41598-020-68597-9.
抄録
Monilinia vaccinii-corymbosi (Reade) Honey (M.vc)によるMonilinia bight病は、野生ブルーベリーの栽培地域に深刻な被害と経済的損失をもたらしている。この原因菌に対する野生ブルーベリーの表現型の防御反応を制御する分子機構はまだ十分にはわかっていない。標的遺伝子発現の変化を測定するためには、定量的リアルタイムPCR（qPCR）を用いた遺伝子発現の信頼性の高い定量が不可欠である。正確な正規化の重要な側面は、適切な参照遺伝子の選択である。本研究では、M.vc を用いて 2 倍体および 4 倍体の野生ブルーベリーの花組織における 7 つの候補参照遺伝子（GAPDH、UBC9、UBC28、TIP41、CaCSa、PPR および RH8）の発現安定性を評価した。発現安定性は、geNorm, NormFinder, BestKeeper, deltaCt, RefFinderの5つのアルゴリズムを用いて計算した。その結果、UBC9とGAPDHが最も安定な参照遺伝子であり、RH8とPPRが最も安定な参照遺伝子であることが示された。さらに、解析した参照遺伝子の妥当性を検証するために、感染時の4つの時点における両表現型について、発症関連タンパク質遺伝子（PR3）の発現レベルを解析した。この結果は、野生のブルーベリー種における相対的な遺伝子発現レベルの定量化を含む今後の研究に有益であると考えられる。
Monilinia blight disease caused by Monilinia vaccinii-corymbosi (Reade) Honey (M.vc) causes severe damage and economic losses in wild blueberry growing regions. Molecular mechanisms regulating defence responses of wild blueberry phenotypes towards this causal fungus are not yet fully known. A reliable quantification of gene expression using quantitative real time PCR (qPCR) is fundamental for measuring changes in target gene expression. A crucial aspect of accurate normalisation is the choice of appropriate reference genes. This study evaluated the expression stability of seven candidate reference genes (GAPDH, UBC9, UBC28, TIP41, CaCSa, PPR and RH8) in floral tissues of diploid and tetraploid wild blueberry phenotypes challenged with M.vc. The expression stability was calculated using five algorithms: geNorm, NormFinder, BestKeeper, deltaCt and RefFinder. The results indicated that UBC9 and GAPDH were the most stable reference genes, while RH8 and PPR were the least stable ones. To further validate the suitability of the analyzed reference genes, the expression level of a pathogenesis related protein gene (i.e., PR3) was analysed for both phenotypes at four time points of infection. Our results may be beneficial for future studies involving the quantification of relative gene expression levels in wild blueberry species.