AutoCloner: 多クローンにおける全遺伝子クローニングのための自動同族体特異的プライマーデザイン

AutoCloner: automatic homologue-specific primer design for full-gene cloning in polyploids.

• Alexander Coulton
• Keith J Edwards

抄録

背景:

小麦のような多形生物は、分子生物学の中で最も単純な手順さえも複雑にしている。作物のゲノム配列の知識は急速に増加しているが、科学界は、すべての種の完全な汎ゲノムを作成するにはまだ長い道のりを歩んでいる。そのため、ポリメラーゼ連鎖反応やサンガー塩基配列決定法は、多くの品種の作物の遺伝子配列を特徴づけるための方法として広く使われています。ポリプロイドにおけるゲノム間の配列類似性が高いということは、3'尾部にSNPを組み込むことでプライマーがホメオログ特異的でない場合、標的配列以外の配列も増幅されることを意味します。小麦における遺伝子クローニングの現在のコンセンサスは、長いバイオインフォマティクスパイプラインの中で多くのステップを手作業で行うことです。

BACKGROUND: Polyploid organisms such as wheat complicate even the simplest of procedures in molecular biology. Whilst knowledge of genomic sequences in crops is increasing rapidly, the scientific community is still a long way from producing a full pan-genome for every species. Polymerase chain reaction and Sanger sequencing therefore remain widely used as methods for characterizing gene sequences in many varieties of crops. High sequence similarity between genomes in polyploids means that if primers are not homeologue-specific via the incorporation of a SNP at the 3' tail, sequences other than the target sequence will also be amplified. Current consensus for gene cloning in wheat is to manually perform many steps in a long bioinformatics pipeline.

結果:

ここでは、作物遺伝子クローニングのための完全自動化されたパイプラインであるAutoCloner ( www.autocloner.com )を紹介します。AutoClonerは、ユーザーから興味のある配列を受け取り、特定の多形作物のゲノムアセンブリに対して基本的なローカルアラインメント検索ツール(BLAST)検索を行います。相同な配列は、次に、入力された配列と一緒に、一塩基多型（SNP）のために採掘される多重配列アラインメントにコンパイルされます。次に、関心のある遺伝子全体をカバーする可能性のあるプライマーの様々な組み合わせが作成され、Primer3によって評価されます；最高のスコアを持つプライマーのセット、およびすべてのSNPの位置にあるすべての可能なプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためにユーザーに返されます。現在のゲノム配列を持たないコムギ品種Apogeeにおいて、AutoClonerを用いて興味のある様々な遺伝子をクローニングすることに成功した。また、小麦ゲノムアッセンブリーから得られた～80,000個の高信憑性遺伝子モデルを用いて、パイプラインを実行することに成功しています。

RESULTS: Here we present AutoCloner ( www.autocloner.com ), a fully automated pipeline for crop gene cloning that includes a free-to-use web interface for users. AutoCloner takes a sequence of interest from the user and performs a basic local alignment search tool (BLAST) search against the genome assembly for their particular polyploid crop. Homologous sequences are then compiled with the input sequence into a multiple sequence alignment which is mined for single-nucleotide polymorphisms (SNPs). Various combinations of potential primers that cover the entire gene of interest are then created and evaluated by Primer3; the set of primers with the highest score, as well as all possible primers at every SNP location, are then returned to the user for polymerase chain reaction (PCR). We have successfully used AutoCloner to clone various genes of interest in the Apogee wheat variety, which has no current genome sequence. In addition, we have successfully run the pipeline on ~ 80,000 high-confidence gene models from a wheat genome assembly.

結論:

AutoClonerは、これまでは手作業で行われていたポリロイドの遺伝子クローニングのためのプライマーデザインを完全に自動化した初めてのツールです。AutoClonerのウェブインターフェースは、研究者がソフトウェアをダウンロードしたり、興味のある配列以外の詳細を入力したりする必要がなく、遺伝子クローニングのためのシンプルで効果的なポリロイドのプライマーデザイン方法を提供しています。

CONCLUSION: AutoCloner is the first tool to fully-automate primer design for gene cloning in polyploids, where previously the consensus within the wheat community was to perform this process manually. The web interface for AutoCloner provides a simple and effective polyploid primer-design method for gene cloning, with no need for researchers to download software or input any other details other than their sequence of interest.