アミロイドβペプチドは神経細胞におけるVAMP-2とSNAP-25の間の相互作用をFRET/FLIMで決定することで阻害する

Amyloid-β Peptides Disrupt Interactions Between VAMP-2 and SNAP-25 in Neuronal Cells as Determined by FRET/FLIM.

• Nidhi Sharda
• Thomas Pengo
• Zengtao Wang
• Karunya K Kandimalla

抄録

背景:

アルツハイマー病（AD）脳で流行しているシナプス機能障害は密接に脳実質のアミロイドβ（Aβ）ペプチドの増加蓄積に関連付けられています。Aβペプチドは、主にVAMP-2、SNAP-25、およびシンタキシン-1によって形成されるSNAREタンパク質複合体によって促進される、シナプス小胞融合および神経伝達物質の放出を妨害することによって、シナプス機能障害を誘発すると広く信じられている。しかし、最終的にシナプス小胞融合を阻害するSNAREタンパク質とAβとの相互作用についてはよくわかっていない。

BACKGROUND: Synaptic dysfunction prevalent in Alzheimer's disease (AD) brain is closely associated with increased accumulation of amyloid-β (Aβ) peptides in the brain parenchyma. It is widely believed that Aβ peptides trigger synaptic dysfunction by interfering with the synaptic vesicular fusion and the release of neurotransmitters, primarily facilitated by the SNARE protein complexes formed by VAMP-2, SNAP-25, and syntaxin-1. However, Aβ interactions with SNARE proteins to ultimately disrupt synaptic vesicular fusion are not well understood.

目的:

本研究では、AβペプチドがSNARE複合体に及ぼす影響を明らかにすることを目的としています。

OBJECTIVE: Our objective is to elucidate mechanisms by which Aβ peptides perturb SNARE complexes.

方法:

N末端にセルリアン（Cer）で標識されたVAMP-2（FRETドナー）と、N末端にシトリン（Cit）で標識されたSNAP-25（FRETアクセプター）の動的相互作用に対するAβペプチドの影響を調べるために、フォルスター（蛍光）共鳴エネルギー移動（FRET）と蛍光寿命顕微鏡（FLIM）を用いた強度（定性）と寿命（定量）に基づく測定を行った。また、シナプス前膜上のエキソサイトーシス位置でのFRETとFLIMの相互作用を、自発的および高カリウム誘発条件下で記録した。さらに、フルオレセイン標識Aβ（F-Aβ）ペプチドの細胞内蓄積とCer-VAMP2との共局在性を共焦点顕微鏡で調べた。

METHODS: Intensity (qualitative) and lifetime (quantitative) based measurements involving Forster (fluorescence) resonance energy transfer (FRET) followed by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) were employed to investigate the effect of Aβ peptides on dynamic interactions between VAMP-2, labeled with cerulean (Cer) at the N-terminus (FRET donor), and SNAP-25 labeled with citrine (Cit) on the N-terminus (FRET acceptor). The FRET and FLIM interactions at the exocytosis locations on the pre-synaptic membrane were recorded under spontaneous and high potassium evoked conditions. Moreover, cellular accumulation of fluorescein labeled Aβ (F-Aβ) peptides and their co-localization with Cer-VAMP2 was investigated by confocal microscopy.

結果:

F-Aβ40およびF-Aβ42は、分化したN2A細胞によって内部化され、そこでCer-VAMP2とコロケーションをとる。Aβ40とAβ42の両方は、FRET/FLIMで決定されたように、N2A細胞におけるCer-VAMP2とCit-SNAP25のN末端間の相互作用を減少させる。

RESULTS: The F-Aβ40 and F-Aβ42 are internalized by differentiated N2A cells, where they colocalize with Cer-VAMP2. Both Aβ40 and Aβ42 decrease interactions between the N-termini of Cer-VAMP2 and Cit-SNAP25 in N2A cells, as determined by FRET/FLIM.

結論:

Aβ40およびAβ42は、VAMP-2とSNAP-25のN末端相互作用を阻害することで、シナプス小胞のドッキングと融合に重要なSNARE複合体の形成を直接的に阻害することができる。

CONCLUSION: By perturbing the N-terminal interactions between VAMP-2 and SNAP-25, Aβ40 and Aβ42, can directly interfere with the SNARE complex formation, which is critical for the docking and fusion of synaptic vesicles.