HULCの過剰発現は、NLRP3/Caspase-1/IL-1βシグナル伝達経路阻害を介してmiR-377-5pを標的とした低酸素/再酸素化心筋細胞のアポトーシスを抑制し、心筋虚血/再灌流障害を抑制することを明らかにした

Overexpression of lncRNA HULC Attenuates Myocardial Ischemia/reperfusion Injury in Rat Models and Apoptosis of Hypoxia/reoxygenation Cardiomyocytes via Targeting miR-377-5p through NLRP3/Caspase‑1/IL‑1β Signaling Pathway Inhibition.

• Huiqing Liang
• Fangjiang Li
• Huixian Li
• Rui Wang
• Meiling Du

抄録

目的:

急性心筋梗塞（AMI）は心筋組織の壊死と炎症反応の活性化を特徴とする。本研究では、ラットモデルにおける心筋虚血/再灌流（I/R）傷害に対する肝癌（HULC）で高発現しているlong noncoding RNA（lncRNA）の保護効果と心筋細胞のアポトーシスのメカニズムを明らかにすることを目的としています。

OBJECTIVE: Acute myocardial infarction (AMI) is characterized by myocardial tissue necrosis and activation of inflammatory response. This study aims to elucidate the potential mechanism underlying the protective effects of long non-coding RNA (lncRNA) highly up-regulated in liver cancer (HULC) against myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury in rat models and apoptosis of cardiomyocytes.

方法:

我々はまず、心筋虚血/再灌流(I/R)傷害のラットモデルと、低酸素/再酸素化(H/R)傷害のラット心筋細胞(H9c2細胞)モデルを確立した。スプラague-Dawley（SD）新生児ラットを、それぞれシャム、I/R、I/R+microRNA（miR）-377-5p mimic、I/R+miR-377-5p antagomirの4群に無作為に割り付けた。その後、病理組織学的検査を行った。アポトーシスは、トランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンドラベリング（TUNEL）染色により評価した。細胞活力はMTTアッセイを用いて測定した。クレアチンキナーゼMB（CK-MB）、心筋トロポニンI（cTnI）、インターロイキン（IL）-6（IL-6）および腫瘍壊死因子α（TNF-α）の濃度は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により検出した。Cleaved-Caspase-3、Caspase-3、NOD様受容体P3（NLRP3）、Caspase-1、およびIL-1βの発現は、免疫組織化学（IHC）またはウェスタンブロット分析により解析した。

METHODS: We firstly established rat models of myocardial I/R injury and rat cardiomyocyte (H9c2 cells) models of hypoxia/reoxygenation (H/R) injury. Sprague-Dawley (SD) neonatal rats were randomized into four groups: sham, I/R, I/R+ microRNA (miR) -377-5p mimic, and I/R+ miR-377-5p antagomir, respectively. Then, histopathological examination was applied. Apoptosis was evaluated by transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) staining. Cell vitality was measured using MTT assay. The concentrations of creatine kinase MB (CK-MB), cardiac troponin I (cTnI), interleukin (IL) -6 (IL-6), and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The expression of Cleaved-Caspase-3, Caspase-3, NOD-like receptor P3 (NLRP3), Caspase-1, and IL-1β was analyzed by immunohistochemical (IHC) or Western blot analysis.

結果:

その結果、HULCがダウンレギュレートされ、miR-377-5pがアップレギュレートされることが明らかになった。miR-377-5pの過剰発現は心筋機能障害とアポトーシスを増加させ、IL-6とTNF-αの形成と分泌を活性化させた。また、miR-377-5pのサイレンシングを前処理したところ、反対の結果が得られた。その結果、HULCはmiR-377-5pのスポンジになっていることが明らかになった。また、NLRP3/Caspase-1/IL-1βがmiR-377-5pの標的軸であることも明らかになった。また、HULCの過剰発現によるH9c2細胞の生存率や炎症に対する保護効果は、miR-377-5pのサイレンシングによって相殺された。最後に、HULC-miR-377-5p -NLRP3/Caspase1/IL-1β軸がH/R誘発H9c2細胞のアポトーシスと炎症を制御していることが示唆された。

RESULTS: We found that HULC was downregulated and miR-377-5p was upregulated in IR-injured myocardial tissue and the H/R-induced H9c2 cell. Overexpression of miR-377-5p increased myocardial dysfunction and apoptosis and activated formation and secretion of IL-6 and TNF-α. The preprocessing of miR-377-5p silencing emerged opposite results. Strikingly, dual luciferase reporter assay showed that HULC was a sponge of miR-377-5p. Subsequently, mechanism experiments revealed that NLRP3/Caspase‑1/IL‑1β was a target axis of miR-377-5p. In vitro, the protective effect of HULC overexpression on H9c2 cell viability and inflammation was offset by miR-377-5p silencing. Finally, rescue assay suggested that HULC-miR-377-5p -NLRP3/Caspase‑1/IL‑1β axis regulated the apoptosis and inflammation of H/R-induced H9c2 cells.

結論:

これらの結果から、心筋のI/R損傷およびH/R心筋細胞のアポトーシスに対するHULCの保護効果は、NLRP3/Caspase-1/IL-1βシグナル伝達経路の阻害に部分的に依存していることが示唆された。

CONCLUSIONS: Overall, these results indicate that the protective effect of HULC against myocardial I/R injury and H/R cardiomyocyte apoptosis partially relies on the inhibition of NLRP3/Caspase‑1/IL‑1β signaling pathway.