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植物葉緑体リボソームと細胞質リボソームの分離とペアプロテオームプロファイリング
Separation and Paired Proteome Profiling of Plant Chloroplast and Cytoplasmic Ribosomes.
PMID: 32674508 DOI: 10.3390/plants9070892.
抄録
従来の植物リボソームの調製法では、葉緑体リボソームや細胞質リボソームのサブユニットを翻訳画分から分離することができなかった。我々は、プロテアーゼ保護された植物抽出物の最適化スクロース密度勾配遠心分離法を用いて、葉、根、種子組織からこれらのリボソーム複合体を調製する方法を確立した。この方法は、非翻訳性の30Sと40Sリボソームサブユニットを共精製し、非翻訳性の50Sと60Sサブユニットを分離し、低オリゴマー性ポリソームから組み立てられたモノソームを分離した。リボソーム分画とマイクロ流路を用いたrRNA解析とプロテオミクスを組み合わせることで、rRNAとリボソームタンパク質（RP）の組成を特徴付けた。細胞質および葉緑体リボソーム複合体の同一性、および60S-80S沈降区間におけるリボソーム生合成因子の存在を検証した。葉組織のインビボでの架橋はリボソーム生合成複合体を安定化させたが、ポリソーム流出を誘発した。架橋を省略して、確立されたペア分画およびプロテオーム解析は、植物の葉緑体および細胞質リボソーム画分の相対的な量をモニターし、一過性に関連するバイオジェネシス因子を含むRP組成およびリボソーム関連タンパク質の解析を可能にした。
Conventional preparation methods of plant ribosomes fail to resolve non-translating chloroplast or cytoplasmic ribosome subunits from translating fractions. We established preparation of these ribosome complexes from leaf, root, and seed tissues by optimized sucrose density gradient centrifugation of protease protected plant extracts. The method co-purified non-translating 30S and 40S ribosome subunits separated non-translating 50S from 60S subunits, and resolved assembled monosomes from low oligomeric polysomes. Combining ribosome fractionation with microfluidic rRNA analysis and proteomics, we characterized the rRNA and ribosomal protein (RP) composition. The identity of cytoplasmic and chloroplast ribosome complexes and the presence of ribosome biogenesis factors in the 60S-80S sedimentation interval were verified. In vivo cross-linking of leaf tissue stabilized ribosome biogenesis complexes, but induced polysome run-off. Omitting cross-linking, the established paired fractionation and proteome analysis monitored relative abundances of plant chloroplast and cytoplasmic ribosome fractions and enabled analysis of RP composition and ribosome associated proteins including transiently associated biogenesis factors.