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ウシおよびヒツジにおける 20 種類の免疫マーカーを検出するためのリアルタイム PCR パネルの開発と評価
Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep.
PMID: 32673891 DOI: 10.1016/j.vetimm.2020.110092.
抄録
家畜の感染症の異なる転写パターンを理解するためには、免疫マーカーのパネルを確立することが最も重要である。ウシとヒツジのための市販の免疫学的アッセイ法は、これらの種の抗体がないため、現在のところ限られています。SYBR Greenに基づくリアルタイム定量PCR（qPCR）は反芻動物のサイトカイン転写を研究するために最も一般的に使用されている方法であるにもかかわらず、標準化の欠如は、様々な反芻動物の病気の研究におけるその実施に障害となっている。信頼性の高い qPCR 結果を得るためには、最適な正規化のための参照遺伝子の選択、プライマーセット間のアニーリング温度のばらつき、アッセイの特異性と感度など、いくつかの変数を考慮する必要がある。本研究では、共通の熱サイクル温度で増幅するように最適化された複数のプライマーセットを用いて、SYBR Green ベースの qPCR を用いて、ウシおよび卵巣サンプルの免疫マーカーのパネルを費用対効果の高い方法で開発し、検証しました。20個のプライマーセットを設計し、ウシおよびウシのテンプレート中の免疫マーカー（IL-1b、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-23、TNF-α、IFN-γ、IFN-α、Ki-67、NFkB-65、TLR-3、TLR-4、TLR-8、およびRig-1）を定量した。最適な正規化および適切な参照遺伝子の選択のために、5つの参照遺伝子の転写を測定するプライマーセットもパネルに含まれていた。増幅効率、直線性および特異性は、すべての標的遺伝子について検証した。最適な増幅条件は、Ki67を除くすべての遺伝子標的について、卵巣およびウシサンプルの両方で達成された。3種類の異なる処理（PMA/Ionomycin、コンカナバリンA（Con A）、ポークウィードマイトジェン（PWM））で刺激した羊末梢血単核細胞（PBMCs）から得られた卵とウシのmRNAの相対定量試験を行った。その結果、ポークウィードとコンカナバリンAは標的遺伝子のほとんどの転写を効率的に誘導したが、PMA/Ionomycinは誘導が弱かった。最後に、異なるワクチンで刺激したウシ単球由来樹状細胞（MoDCs）を用いて、パネルの有用性を評価した。その結果、狂犬病ワクチンによる特定の炎症促進遺伝子の転写パターンの誘導が確認された。以上の結果から、単一の試薬とプロトコールを使用して、卵やウシの免疫マーカーを迅速に測定することができる拡張リアルタイムPCRパネルの効率性と有用性を検証した。
The establishment of a panel of immune markers is of paramount importance to understand the different transcription patterns of infectious diseases in livestock. The array of commercially available immunological assays for cattle and sheep is currently limited, due to the lack of antibodies for these species. Even though SYBR Green based real time quantitative PCR (qPCR) is the most commonly used method to study cytokine transcription in ruminants, a lack of standardization impairs its implementation in the study of different ruminant diseases. In order to obtain reliable qPCR results, several variables need to be considered: choice of reference genes for optimal normalization, variation of annealing temperature among primer sets, and assay specificity and sensitivity. In this study, we developed and validated a panel of immune markers in bovine and ovine samples using SYBR Green based qPCR in a cost-effective way with multiple primer sets optimised to amplify at a common thermal cycling temperature. Twenty primer sets were designed to quantify immune markers (IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, TNF-α, IFN-γ, IFN-α, Ki-67, NFkB-65, TLR-3, TLR-4, TLR-8 and Rig-1) in ovine and bovine templates. For optimal normalization and selection of suitable reference genes, primer sets that measure the transcription of five reference genes were also included in the panel. The amplification efficiency, linearity and specificity was validated for all target genes. Optimal amplification conditions were achieved in both ovine and bovine samples for all gene targets, with the exception of Ki67. Relative quantification studies were performed on ovine and bovine mRNA obtained from sheep peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated with three different treatments (PMA/Ionomycin, Concanavalin A (Con A) and pokeweed mitogen (PWM)). Pokeweed and ConA efficiently induced gene transcription of most of the targeted genes, while PMA/Ionomycin showed a weaker induction. Finally, we further assessed usability of our panel by running it on bovine monocyte derived dendritic cells (MoDCs) stimulated with different vaccines. Results confirmed the induction of a specific pro-inflammatory gene transcription pattern by rabies vaccine, which resembles the one occurring during viral infection. Altogether, we validated the efficiency and usability of an extended real-time PCR panel that gives the possibility to rapidly measure a broad spectrum of ovine and bovine immune markers by using a single set of reagents and protocol thus representing a valid and cost-effective tool for research purposes.
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