液体クロマトグラフィーと高分解能タンデム質量分析法を結合させた液体クロマトグラフィーによるEscherichia coli、Pseudomonas putidaおよびPseudomonas taiwanensisからの脂質Aの同定と構造的特徴付け

Identification and structural characterization of lipid A from Escherichia coli, Pseudomonas putida and Pseudomonas taiwanensis by liquid chromatography coupled to high resolution-tandem mass spectrometry.

• Matti Froning
• Patrick O Helmer
• Heiko Hayen

抄録

評価方法:

脂質Aは、グラム陰性菌からの外膜の主成分であるリポ多糖類層の一部である。哺乳類では、組織内のグラム陰性菌の存在を感知して識別することができ、細菌感染症の発症に重要な役割を果たしています。また、脂質Aはヒトワクチンのアジュバントとしても使用されており、その構造解析の重要性が強調されています。

RATIONALE: Lipid A is a part of the lipopolysaccharide layer, which is a main component of the outer membrane from gram-negative bacteria. It can be sensed by mammalians to identify the presence of gram-negative bacteria in their tissues and plays a key role in the pathogenesis of bacterial infections. Lipid A is also used as an adjuvant in human vaccines, emphasizing the importance of its structural analysis.

方法:

様々な脂質A種を区別して特徴づけるために、LC/MS/MS法を開発しました。異なる細菌からの脂質Aの単離は、軽度の酸加水分解に続いて、修正されたBlighとDyer抽出によって行われた。クロマトグラフィーは、二官能性逆相をベースとした固定相を用いて行った。負のエレクトロスプレーイオン化を用いた高分解能質量分析法を適用し、高エネルギー衝突解離（HCD）を利用したタンデム質量分析法（MS/MS）を用いて、脂質Aのバックボーンの異なる位置に側鎖を割り当てることができました。

METHODS: In order to distinguish and characterize various lipid A species, a LC/MS/MS method was developed. Isolation of lipid A from different bacteria was carried out by a modified Bligh and Dyer extraction following a mild acid hydrolysis. Chromatography was performed using a bifunctional reversed phase-based stationary phase. High resolution mass spectrometry using negative electrospray ionization was applied and tandem mass spectrometry (MS/MS) experiments utilizing higher-energy collisional dissociation (HCD) generated diagnostic product ions, which allowed the assignment of the side chains to distinct positions of the lipid A backbone.

結果:

この方法は、Escherichia coli（大腸菌）、Pseudomonas putida（P. putida）およびPseudomonas taiwanensis（P. taiwanensis）の脂質A分離に適用された。異なる種は、それらの正確な質量によって同定され、その構造はMS/MS実験によって特徴付けられた。大腸菌からの以前に記載された脂質Ａ構造を同定し、その構造をＭＳ／ＭＳにより確認した。また、バイオテクノロジーに関連する菌株P. putidaとP. taiwanensisについては、これまでMSでしか分析されていなかった種をMS/MSで確認した。さらに、これまで文献に記載されていなかったいくつかの脂質A種を発見した。

RESULTS: The method was applied to lipid A isolations of Escherichia coli (E. coli), Pseudomonas putida (P. putida) and Pseudomonas taiwanensis (P. taiwanensis). Different species were identified by their accurate masses and their structure was characterized by MS/MS experiments. Previously described lipid A structures from E. coli were identified and their structures confirmed by MS/MS. For the biotechnologically relevant strains P. putida and P. taiwanensis, we confirmed species by MS/MS, which have previously only been analysed by MS. In addition, several lipid A species were discovered which were not described in the literature before.

結論:

HPLCとMS/MSをハイフン化することで、異なるグラム陰性菌由来の様々な脂質A種の選択的かつ高感度な同定と構造解析が可能となった。これらの脂質A種は、脂肪酸やリン酸基などの置換された側鎖に様々な種類がありました。特徴的なプロダクトイオンは、脂質Aのバックボーンの異なる位置に側鎖を割り当てることを容易にした。

CONCLUSIONS: The hyphenation of HPLC and MS/MS enabled the selective and sensitive identification and structural characterization of various lipid A species from different gram-negative bacteria. These species varied in their substituted side chains, speaking of fatty acids and phosphate groups. Characteristic product ions facilitated the assignment of side chains to distinct positions of the lipid A backbone.

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