CRISPR/Cas9を介した上咽頭癌細胞株におけるSRPK1とSRPK2のダブルノックアウト

CRISPR/Cas9-mediated double knockout of SRPK1 and SRPK2 in a nasopharyngeal carcinoma cell line.

• Pongphol Prattapong
• Chawalit Ngernsombat
• Sathid Aimjongjun
• Tavan Janvilisri

抄録

背景:

セリ ンアルギニンプロテインキナーゼ（SRPK）は、スプライシング因子タンパク質のリン酸化を介して、代替スプライシングイベントを制御しています。SRPK1とSRPK2は、様々なタイプの癌において癌発症に関与していることが報告されています。これまで、SRPK1/2の機能を一時的に停止させるためには、SRPK1/2特異的阻害剤やsiRNA（small interfering RNA）が用いられてきましたが、腫瘍形成におけるSRPK1/2の役割を調べるためのツールとして、SRPK1/2安定ノックアウトがん細胞を作製する試みは行われていませんでした。

BACKGROUND: Serine-arginine protein kinase (SRPK) is a regulator of alternative splicing events via phosphorylation of splicing factor proteins. Oncogenic roles of SRPK1 and SRPK2 have been reported in various types of cancer. To date, only SRPK1/2 specific inhibitors and small interfering RNA (siRNA) have been used for halting their function momentarily; however, there is no attempt to generate SRPK1/2 stable knockout cancer cells as a tool to investigate their roles in tumorigenesis.

エイム:

したがって、我々の目的は、安定したSRPK1またはSRPK2ノックアウトとSRPK1/2ダブルノックアウトを有する上咽頭癌（NPC）細胞株をモデルとして確立し、NPCにおけるそれらの潜在的な役割を調べることである。

AIM: Our objective is therefore to establish a nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line with stable SRPK1 or SRPK2 knockout and SRPK1/2 double knockout as a model to investigate their potential roles in NPC.

方法と結果:

NPC細胞株の代表としてCNE1を選択し、SRPK1/2タンパク質のシングルノックアウトおよびダブルノックアウトを作製した。cas9、緑色蛍光タンパク質（GFP）、およびgRNA発現を有するSRPK1/2 KOプラスミドを、プロマイシン耐性、赤色蛍光タンパク質（RFP）、および相同組換えのための5'および3'アーム配列を含むSRPK1/2ホモロジー指向修復（HDR）プラスミドと共トランスフェクトし、CNE1細胞にトランスフェクトした。ＧＦＰおよびＲＦＰ発現を有するトランスフェクトされたＣＮＥ１細胞を、ピューロマイシン含有培地でのさらなる処理のために、蛍光活性化セルソーティングを介して選別した。このステップは、ＳＲＰＫ１およびＳＲＰＫ２の安定なシングルノックアウトを生成した。SRPK2ノックアウトNPC細胞を、挿入物の切除のためのCreプラスミドによるトランスフェクションを介して二重ノックアウト生成のための前駆体として使用し、ピュロマイシン感受性SRPK2ノックアウトクローンを生成した。ピュロマイシン感受性SRPK2ノックアウト細胞をSRPK1 KO/HDRプラスミドでトランスフェクションし、ピュロマイシン含有培地で処理した。ピュロマイシン耐性のSRPK1/2安定二重ノックアウト細胞を増殖させ、対応するタンパク質の発現をウエスタン免疫ブロット分析により確認した。

METHODS AND RESULTS: CNE1 was selected as a representative of NPC cell lines to create single and double knockout of SRPK1/2 proteins. SRPK1/2 KO plasmid with cas9, green fluorescent protein (GFP), and gRNA expression was cotransfected with SRPK1/2 homology-directed repair (HDR) plasmid containing puromycin resistance, red fluorescent protein (RFP), and 5' and 3' arm sequence for homologous recombination to CNE1 cells. The transfected CNE1 cells with GFP and RFP expression were sorted through fluorescence-activated cell sorting for further treatment with puromycin containing medium. This step generated stable single knockout of SRPK1 and SRPK2. The SRPK2 knockout NPC cells were used as a precursor for double knockout generation via transfection with Cre plasmid for excision of inserted material to generate puromycin-sensitive SRPK2 knockout clone. The puromycin-sensitive SRPK2 knockout cells were transfected with SRPK1 KO/HDR plasmid and treated with puromycin-containing medium. The puromycin-resistant cells of SRPK1/2 stable double knockout were expanded, and the corresponding protein expression was confirmed by western immunoblotting analysis.

結論:

NPCにおけるSRPK1/2のスプライシング機構の解明を目的として、NPC細胞株を用いてCRISPR/Cas9システムを用いてSRPK1/2のシングルノックアウトとダブルノックアウトを行った。

CONCLUSION: Single and double knockout of SRPK1/2 were established using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated 9 (Cas9) system in an NPC cell line as a model for investigation of their splicing mechanism in NPC.

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