電子スピン共鳴を用いて検出した一重項酸素発生量に基づく新しい光安全性試験法の開発

Development of a new photosafety test method based on singlet oxygen generation detected using electron spin resonance.

• Masumi Hinoshita
• Takayuki Abe
• Asako Sato
• Yosuke Maeda
• Masahiro Takeyoshi

抄録

医薬品や化粧品などの消費者製品に使用される化学物質の光安全性評価は非常に重要である。現在、光安全性評価のための光反応性化学物質の検出には、in vitro 3T3中性赤血球取り込み光毒性試験（NRU PT）と活性酸素種（ROS）測定法の2つの非動物試験が用いられています。しかし、これら2つの試験は疎水性化学物質への適用が困難である。本研究では、4-ヒドロキシ-2,2,6,6,6-テトラメチルピペリジンをスピントラップ試薬として用いたESR分光法による照射後の一重項酸素発生の検出に基づいて、疎水性化学物質にも適用可能な新しい光安全性試験法（ESR-PT）の開発を試みた。定量的な評価を行うために、試験混合物の照射後の相対強度の増加をビヒクルコントロール溶液の照射後の相対強度の増加で正規化した値として計算できる一重項酸素生成(SOF)値を算出した。ESR-PTの性能は、ROSアッセイのすべての熟練化学物質に加えて、疎水性化学物質および3T3-NRU PTおよびROSアッセイで偽陰性と試験された化学物質を含む追加の化学物質を試験することによって評価された。疎水性化学物質を含むすべての化学物質についてSOF値の計算に成功し、光安全性情報に対する暫定的なカットオフ値2.8を用いたESR-PTの精度は100%であった。このことから，SOF値は光安全性評価のための有効なパラメータとなり，今回開発したESR-PTは疎水性化学物質にも適用可能な非動物試験として有望であることが示唆された。

Photosafety evaluations of chemicals used in consumer products, such as pharmaceuticals and cosmetics, are very important. Currently, two non-animal tests for photosafety evaluations, the in vitro 3T3 neutral red uptake phototoxicity test (NRU PT) and the reactive oxygen species (ROS) assay, are used to detect photoreactive chemicals. However, these two tests are difficult to apply to hydrophobic chemicals. In the present study, we attempted to develop a new photosafety test method, named the electron spin resonance-based photosafety test (ESR-PT), that would be applicable even to hydrophobic chemicals based on the detection of singlet oxygen generation after irradiation using ESR spectroscopy with 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine as a spin trap reagent. To achieve a quantitative evaluation, the singlet oxygen formation (SOF) value, which can be calculated as the increment in relative intensity after irradiation of the test mixture normalized by the increment in relative intensity after irradiation of the vehicle control solution, was calculated. The performance of the ESR-PT was evaluated by testing all the proficiency chemicals of the ROS assay plus additional chemicals, including hydrophobic chemicals and chemicals that tested false negative in the 3T3-NRU PT and ROS assay. SOF values were successfully calculated for all the chemicals tested including the hydrophobic chemicals, and the accuracy of the ESR-PT using a tentative cutoff value of 2.8 against the photosafety information was 100%. Therefore, the SOF value could be an effective parameter for photosafety evaluations, suggesting that the newly developed ESR-PT is a promising non-animal test applicable even to hydrophobic chemicals.

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