新しい機能性アッセイを用いた移植レシピエントおよび健康なコントロールにおける抗HCMV細胞媒介免疫応答の評価

Assessing Anti-HCMV Cell Mediated Immune Responses in Transplant Recipients and Healthy Controls Using a Novel Functional Assay.

• Charlotte J Houldcroft
• Sarah E Jackson
• Eleanor Y Lim
• George X Sedikides
• Emma L Davies
• Claire Atkinson
• Megan McIntosh
• Ester B M Remmerswaal
• Georgina Okecha
• Frederike J Bemelman
• Richard J Stanton
• Matthew Reeves
• Mark R Wills

抄録

HCMVの感染、再感染または再活性化は、未治療の固形臓器移植（SOT）患者の60％で発生している。HCMVの管理に対する現在の臨床的アプローチには、先制的および予防的な抗ウイルス治療戦略が含まれる。免疫モニタリングを導入して、ウイルス血症やHCMV媒介疾患のリスクのある患者をよりよく層別化することで、臨床管理が改善される可能性がある。現在のアプローチでは、HCMVの機能的制御の代理として、主にIEとpp65タンパク質に特異的なT細胞IFNγ反応を定量化しています。しかし、これらのアプローチは限られた予測能力しか持っていません。我々は、D+R-腎移植患者のコホートにおいて、免疫優勢なHCMVタンパク質IE1/2、pp65、pp71、gB、UL144、およびUS3に特異的な重複ペプチドプールの拡張パネルに対するIFNγ T細胞応答を縦断的な分析で測定しました。このように抗原の多様性が増加した場合でも、すべての患者で検出可能なT細胞応答が得られたが、一部の患者ではHCMV複製の制御とは相関しなかったことが示された。我々は、抗HCMV細胞媒介免疫を直接測定できるアッセイの開発を望んでいた。我々は3つのアプローチを評価した。(i)全HCMV溶解液または(ii)免疫優勢なHCMVペプチドの定義されたパネルでPBMCを刺激する、または(iii)PBMCと共培養した完全自己感染細胞、または単離されたCD8 T細胞またはNK細胞である。HCMV溶解液での刺激は、しばしば非特異的な抗ウイルス応答を生成し、一方、免疫優勢なHCMVペプチドプールでの刺激は、強力なIFNγ産生にもかかわらず、必ずしも抗ウイルス性ではない応答を生成しました。我々は、IFNγが分泌された抗ウイルス活性のわずかな成分であることを実証した。最後に、抗ウイルスアッセイシステムを用いて、全PBMCの効果を測定し、単離されたCD8 T細胞とNK細胞を用いて、感染した自家皮膚線維芽細胞におけるHCMVを制御した。その結果、PBMC、特にHCMV血清陽性ドナーからのCD8 T細胞の両方がHCMVに対して高度に特異的な抗ウイルス活性を有することが明らかになった。さらに、NK細胞も抗ウイルス活性を有することを示すことができたが、このコントロールのレベルはドナー間で大きく変動し、HCMV血清陽性には依存しなかった。このアプローチを用いて、非ウイルス性のD+R+ SOTレシピエントはHCMVに対して有意で特異的な抗ウイルス活性を有することを示した。

HCMV infection, reinfection or reactivation occurs in 60% of untreated solid organ transplant (SOT) recipients. Current clinical approaches to HCMV management include pre-emptive and prophylactic antiviral treatment strategies. The introduction of immune monitoring to better stratify patients at risk of viraemia and HCMV mediated disease could improve clinical management. Current approaches quantify T cell IFNγ responses specific for predominantly IE and pp65 proteins , as a proxy for functional control of HCMV . However, these approaches have only a limited predictive ability. We measured the IFNγ T cell responses to an expanded panel of overlapping peptide pools specific for immunodominant HCMV proteins IE1/2, pp65, pp71, gB, UL144, and US3 in a cohort of D+R- kidney transplant recipients in a longitudinal analysis. Even with this increased antigen diversity, the results show that while all patients had detectable T cell responses, this did not correlate with control of HCMV replication in some. We wished to develop an assay that could directly measure anti-HCMV cell-mediated immunity. We evaluated three approaches, stimulation of PBMC with (i) whole HCMV lysate or (ii) a defined panel of immunodominant HCMV peptides, or (iii) fully autologous infected cells co-cultured with PBMC or isolated CD8 T cells or NK cells. Stimulation with HCMV lysate often generated non-specific antiviral responses while stimulation with immunodominant HCMV peptide pools produced responses which were not necessarily antiviral despite strong IFNγ production. We demonstrated that IFNγ was only a minor component of secreted antiviral activity. Finally, we used an antiviral assay system to measure the effect of whole PBMC, and isolated CD8 T cells and NK cells to control HCMV in infected autologous dermal fibroblasts. The results show that both PBMC and especially CD8 T cells from HCMV seropositive donors have highly specific antiviral activity against HCMV. In addition, we were able to show that NK cells were also antiviral, but the level of this control was highly variable between donors and not dependant on HCMV seropositivity. Using this approach, we show that non-viraemic D+R+ SOT recipients had significant and specific antiviral activity against HCMV.

Copyright © 2020 Houldcroft, Jackson, Lim, Sedikides, Davies, Atkinson, McIntosh, Remmerswaal, Okecha, Bemelman, Stanton, Reeves and Wills.