CRISPR-sub.CRISPR-Cas9によるヒト細胞内のDNA置換変異の解析

CRISPR-sub: Analysis of DNA substitution mutations caused by CRISPR-Cas9 in human cells.

• Gue-Ho Hwang
• Jihyeon Yu
• Soyeon Yang
• Woo Jae Son
• Kayeong Lim
• Heon Seok Kim
• Jin-Soo Kim
• Sangsu Bae

抄録

CRISPR-Cas9は、ガイドRNAに依存した方法で、目的の標的部位でDNA切断を誘導し、その結果として生じる非相同末端結合（NHEJ）を含むDNA修復過程の活性によってDNA編集を行う。NHEJ修復は、DNA切断部位の近くに小さな挿入や欠失（インデル）を頻繁に引き起こしますが、ヌクレオチド置換を引き起こすことはほとんどありません。遺伝子編集分野において、細胞のバルク集団におけるインデルおよび置換頻度を評価するための主要な手段は、ハイスループットシーケンシングである。しかし、実験的に誘発された置換エラーの中に埋もれている善意の置換をハイスループットシークエンシングデータから検出することは困難である。そこで私たちは、MockとCRISPRで処理したサンプルを比較することで、ハイスループットシークエンシングデータ中のCas9による置換を統計的に検出する新しい解析手法CRISPR-Subを開発しました。まず、CRISPR処理したサンプルとMock処理したサンプルでは、置換変異が定量的に多く観察される（p>0.001）「ホットスポット」と呼ばれる標的配列の位置をピンポイントで特定しました。このように定義されたホットスポット位置での置換変異を「見かけの置換」と呼び、最終的には各ターゲットについて「見かけの置換頻度」を算出した。HeLa細胞の51の内因性標的部位を調べた結果、平均見かけの置換頻度はすべてのクエリで0.8％であり、見かけの置換はCRISPR-Cas9開裂部位の近くで頻繁に発生し、ヌクレオチド変換は意味のあるヌクレオチド選好パターンを示さないことがわかった。さらに、リガーゼIVをコードする遺伝子をノックアウトしてNHEJ阻害細胞株（ ）を作製したところ、見かけの置換頻度は細胞内で有意に減少しており、DNAの置換はNHEJ経路によって生成されていることを強く示唆していることがわかった。

CRISPR-Cas9 induces DNA cleavages at desired target sites in a guide RNA-dependent manner; DNA editing occurs through the resulting activity of DNA repair processes including non-homologous end joining (NHEJ), which is dominant in mammalian cells. NHEJ repair frequently causes small insertions and deletions (indels) near DNA cleavage sites but only rarely causes nucleotide substitutions. High-throughput sequencing is the primary means of assessing indel and substitution frequencies in bulk populations of cells in the gene editing field. However, it is difficult to detect bona fide substitutions, which are embedded among experimentally-induced substitution errors, in high-throughput sequencing data. Here, we developed a novel analysis method, named CRISPR-Sub, to statistically detect Cas9-mediated substitutions in high-throughput sequencing data by comparing Mock- and CRISPR-treated samples. We first pinpointed 'hotspot positions' in target sequences at which substitution mutations were quantitatively observed much more often (p > 0.001) in CRISPR- versus Mock-treated samples. We refer to the substitution mutations in defined hotspot positions as 'apparent substitutions' and ultimately calculated 'apparent substitution frequencies' for each target. By examining 51 endogenous target sites in HeLa cells, we found that the average apparent substitution frequency was 0.8% in all queries, that apparent substitutions frequently occur near CRISPR-Cas9 cleavage sites, and that nucleotide conversion showed no meaningful nucleotide preference patterns. Furthermore, we generated NHEJ-inhibited cell lines ( ) by knockout of the gene encoding ligase IV and found that the apparent substitution frequencies were significantly decreased in cells, strongly suggesting that DNA substitutions are generated by the NHEJ pathway.

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