セイウチ（Sander vitreus）のGT-seqパネルは、非モデル生物におけるアンプリコンパネルの効率的な開発と実装のための重要な洞察を提供しています

A GT-seq panel for walleye (Sander vitreus) provides important insights for efficient development and implementation of amplicon panels in non-model organisms.

• Matthew L Bootsma
• Kristen M Gruenthal
• Garrett J McKinney
• Levi Simmons
• Loren Miller
• Greg G Sass
• Wesley A Larson

抄録

Genotyping-in-Thousands by Sequencing (GT-seq)のような標的アンプリコンシーケンシング法は、数千人の個人の数百の遺伝的座位の迅速、正確、かつ費用対効果の高い解析を容易にする。GT-seqパネルの開発は容易ではないが、GT-seqパネル開発の異なるステップに関連したトレードオフを記述した研究は稀である。ここでは、セイウチ（Sander vitreus）の二重目的のGT-seqパネルを構築し、異なる開発とジェノタイピングアプローチに関連するトレードオフについて議論し、独自のGT-seqパネルを構築する研究者への提案を提供する。我々のGT-seqパネルは、ミネソタ州とウィスコンシン州の23個体群から採取された954個体の制限部位関連DNAデータからなる確認セットを使用して開発された。次に、親系統解析と遺伝的ストック同定のために全遺伝子座の有用性を検証するためにシミュレーションを行い、これらの解析のための共同精度を最大化するために600個のプライマーペアを設計した。プライマーの最適化を3回行い、過剰増幅した遺伝子座を除去し、最終的なパネルは436遺伝子座で構成された。また、GT-seqプロセス中のDNA抽出、多重化ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、およびクリーンアップステップのためのさまざまなアプローチを検討した結果、以下のことがわかりました。(1)安価なChelex抽出は、ジェノタイピングのために十分に実行され、(2)いくつかの現在のプロトコルに含まれているエクソヌクレアーゼIとエビアルカリホスファターゼ（ExoSAP）手順は、結果を大幅に改善せず、おそらく不要であること、および(3)それは別々にPCR増幅パネルとアダプターライゲーションの前にそれらを組み合わせることが可能であった。最適化されたGT-seqパネルは保全遺伝学のための貴重な資源であり、我々の発見と提案は無数の分類群におけるその構築に役立つはずである。

Targeted amplicon sequencing methods, such as genotyping-in-thousands by sequencing (GT-seq), facilitate rapid, accurate, and cost-effective analysis of hundreds of genetic loci in thousands of individuals. Development of GT-seq panels is non-trivial, but studies describing trade-offs associated with different steps of GT-seq panel development are rare. Here, we construct a dual-purpose GT-seq panel for walleye (Sander vitreus), discuss trade-offs associated with different development and genotyping approaches, and provide suggestions for researchers constructing their own GT-seq panels. Our GT-seq panel was developed using an ascertainment set consisting of restriction site-associated DNA data from 954 individuals sampled from 23 populations in Minnesota and Wisconsin. We then conducted simulations to test the utility of all loci for parentage analysis and genetic stock identification and designed 600 primer pairs to maximize joint accuracy for these analyses. We conducted three rounds of primer optimization to remove loci that overamplified and our final panel consisted of 436 loci. We also explored different approaches for DNA extraction, multiplexed polymerase chain reaction (PCR) amplification, and cleanup steps during the GT-seq process and discovered the following: (1) inexpensive Chelex extractions performed well for genotyping, (2) the exonuclease I and shrimp alkaline phosphatase (ExoSAP) procedure included in some current protocols did not improve results substantially and was likely unnecessary, and (3) it was possible to PCR amplify panels separately and combine them prior to adapter ligation. Well-optimized GT-seq panels are valuable resources for conservation genetics and our findings and suggestions should aid in their construction in myriad taxa.

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