ヒト血漿中のβ-ラパコンの定量のための液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法の生物分析法の開発と検証

Bioanalytical method development and validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of β-lapachone in human plasma.

• William C Putnam
• Raja Reddy Kallem
• Indhumathy Subramaniyan
• M Shaalan Beg
• Vindhya Edpuganti

抄録

本研究の目的は、ヒト血漿中のβ-ラパコンを定量するための迅速かつ高感度で堅牢な液体クロマトグラフィータンデム質量分析法を開発し、その有効性を検証すること、およびその方法を用いてヒトの臨床サンプルを分析することである。開発した方法では、ヒト血漿中のβ-ラパコンとクリプトタンシノン(内部標準物質)を酢酸エチルを用いた液液液抽出法で抽出しました。クロマトグラフィーの分解能は、Kinetex C18カラムを用いて勾配溶出と0.5mL/minのクロマトグラフィー流量で達成された。β-ラパコンの保持時間は1.98分、クリプトタンシノンの保持時間は2.28分であり、本法の総実行時間は4分であった。 バイオアナリシス法のバリデーションは、米国食品医薬品局（FDA）の規制ガイドラインに準拠して実施した。本法は、高用量および低用量の臨床試験をサポートするために、2つの検量線範囲で検証された。検量線-1は0.25～50ng/mLの範囲をカバーし、検量線-2は50～2000ng/mLの範囲をカバーした。β-ラパコンは、オートサンプラー、ベンチトップ、凍結融解、長期（63日間）安定性試験において、安定性（時間＝0からの変化率-11.6～12.6％）が確認されました。有効な生物分析法を用いて、臨床試験で得られたヒト血漿中のβ-ラパコン濃度を測定した。

The purpose of this work was to develop and validate a rapid, sensitive and robust liquid chromatography tandem mass spectrometric method for the quantification of β-lapachone in human plasma and to use that method to analyze human clinical samples. Sample preparation for the developed method involved liquid-liquid extraction using ethyl acetate for extraction of β-lapachone and cryptotanshinone (internal standard) from human plasma. Chromatographic resolution was achieved on a Kinetex C18 column using a gradient elution and a chromatographic flow rate of 0.5 mL/min. The retention times of β-lapachone and cryptotanshinone were 1.98 and 2.28 min, respectively, and the method had a total run time of 4 min. Bioanalytical method validation was conducted in accordance with the United States Food and Drug Administration regulatory guidelines. The method was validated over 2 calibration ranges in order to support high- and low-dose clinical studies. Calibration curve-1 covered the range of 0.25-50 ng/mL and calibration curve-2 covered the range of 50-2000 ng/mL. The method was determined to be accurate (percent relative errors between -1.07 to 5.36 %), precise (percent relative standard deviations less than 7.4), and sensitive (LLOQ 0.25 ng/mL). β-lapachone was determined to be stable (% change from time = 0 between -11.6 and 12.6 %) across the autosampler, benchtop, freeze/thaw and long-term (63 days) stability studies. The validated bioanalytical method was employed to determine β-lapachone concentrations in human plasma samples from a clinical study.

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