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およびspp.の同時検出のためのデュプレックスリアルタイムPCRアッセイ
Duplex real-time PCR assay for the simultaneous detection of and spp.
PMID: 32667877 DOI: 10.1099/mgen.0.000406.
抄録
グラム陰性環境細菌属のいくつかのメンバーは、最も一般的なものであることと、重篤な感染症と関連している。病原性の可能性があるにもかかわらず、これらの本質的に薬剤耐性のある細菌や疾患における役割についてはほとんど理解されていないため、最適な診断と管理が行われていないのが現状である。ここでは、158種のゲノムについて比較ゲノム解析を行い、種の境界を強固に特定し、いくつかの誤った分類群を再分類し、その属に特異的な遺伝子配列を同定した。次に、我々はブラックホールクエンチャープローブをベースとしたデュプレックスリアルタイムPCRアッセイ、Ac-Axを開発し、精製コロニーとポリ微生物臨床検体の両方から迅速かつ同時検出を可能にした。Ac-Axは，表現型または遺伝子型法を用いてSpp.として同定された119株を対象に試験を行った．これらの日常的な診断法と比較して，デュプレックス法では，16S rRNA遺伝子の塩基配列解析により異なる属名であることが確認された5株のうち，Ac-Axの増幅に失敗した5株について，より優れた同定が得られた．Ac-Axでは、Spp.と、～110ゲノム当量まで定量し、それぞれ～12ゲノム当量と～1ゲノム当量まで検出することができた。非分離株34株と成人嚢胞性線維症喀痰38株の広範な分析と実験室での試験により、デュプレックスアッセイの特異性と感度が確認された。我々は、Ac-Axデュプレックスアッセイが全菌種の同時検出のための堅牢で感度が高く、費用対効果の高い方法を提供し、この重要な病原体群の迅速かつ正確な診断を容易にすることを実証した。
Several members of the Gram-negative environmental bacterial genus are associated with serious infections, with being the most common. Despite their pathogenic potential, little is understood about these intrinsically drug-resistant bacteria and their role in disease, leading to suboptimal diagnosis and management. Here, we performed comparative genomics for 158 spp. genomes to robustly identify species boundaries, reassign several incorrectly speciated taxa and identify genetic sequences specific for the genus and for . Next, we developed a Black Hole Quencher probe-based duplex real-time PCR assay, Ac-Ax, for the rapid and simultaneous detection of spp. and from both purified colonies and polymicrobial clinical specimens. Ac-Ax was tested on 119 isolates identified as spp. using phenotypic or genotypic methods. In comparison to these routine diagnostic methods, the duplex assay showed superior identification of spp. and , with five isolates failing to amplify with Ac-Ax confirmed to be different genera according to 16S rRNA gene sequencing. Ac-Ax quantified both spp. and down to ~110 genome equivalents and detected down to ~12 and ~1 genome equivalent(s), respectively. Extensive analysis, and laboratory testing of 34 non- isolates and 38 adult cystic fibrosis sputa, confirmed duplex assay specificity and sensitivity. We demonstrate that the Ac-Ax duplex assay provides a robust, sensitive and cost-effective method for the simultaneous detection of all spp. and and will facilitate the rapid and accurate diagnosis of this important group of pathogens.