サイズ制御された脂質ナノ粒子のマイクロ流体ベース後処理プロセスの開発とsiRNAデリバリーへの応用

Development of a Microfluidic-Based Post-Treatment Process for Size-Controlled Lipid Nanoparticles and Application to siRNA Delivery.

• Niko Kimura
• Masatoshi Maeki
• Yusuke Sato
• Akihiko Ishida
• Hirofumi Tani
• Hideyoshi Harashima
• Manabu Tokeshi

抄録

有機溶媒注入法に基づく脂質ナノ粒子（LNP）の調製のためのマイクロ流体法は、LNPの正確なサイズ制御を可能にします。有機溶媒注入法は、LNPの調製後、一晩透析や緩衝液での直接希釈などの後処理が必要となります。マイクロ流体ベースの有機溶媒注入法を用いたLNPの生産は、熱力学よりもむしろ速度論によって支配されています。LNPの内膜と外膜からのエタノール除去のキネティクスは、LNPの融合につながる可能性のある膜の構造変化を引き起こす可能性があります。しかし、マイクロ流体後処理がLNPの最終的なサイズに与える影響は十分に理解されていませんでした。ここでは、後処理工程がLNPの最終製品サイズに与える影響を詳細に調べました。LNPの製造には、単純なバッフル装置と、中性リン脂質(1-パルミトイル-2-オレイル-グリセロ-3-ホスホコリン、POPC)とコレステロールからなるモデル脂質系を用いた。LNP懸濁液中の残存エタノールを希釈した後処理のフロー条件がLNPの最終製品サイズに影響を与えることを実証した。これらの知見をもとに、マイクロ流体を用いたLNP製造システムのために、LNP製造領域と後処理領域からなる一体型バッフル装置を開発した。最後に、我々のコンセプトをsmall interfering RNA（siRNA）デリバリーに適用し、siRNAのカプセル化効率、生物学的分布、ノックダウン活性に連続プロセスによる大きな影響がないことを確認した。このマイクロ流体後処理法は、実用化に向けたLNPの製造や、新規LNPベースのナノメディシンの開発に貢献することが期待されます。

Microfluidic methodologies for preparation of lipid nanoparticles (LNPs) based on an organic solvent injection method enable precise size control of the LNPs. After preparation of LNPs, the organic solvent injection method needs some post-treatments, such as overnight dialysis or direct dilution with a buffer solution. LNP production using the microfluidic-based organic solvent injection method is dominated by kinetics rather than thermodynamics. Kinetics of ethanol removal from the inner and outer membranes of LNPs could induce a structural change in the membrane that could lead to fusion of LNPs. However, the effects of microfluidic post-treatment on the final size of LNPs have not been sufficiently understood. Herein, we investigated the effect of the post-treatment processes on the final product size of LNPs in detail. A simple baffle device and a model lipid system composed of a neutral phospholipid (1-palmitoyl-2-oleoyl--glycero-3-phosphocholine, POPC) and cholesterol were used to produce the LNPs. We demonstrated that flow conditions of the post-treatment diluting the remaining ethanol in the LNP suspension affected the final product size of LNPs. Based on the findings, we developed an integrated baffle device composed of an LNP production region and a post-treatment region for a microfluidic-based LNP production system; this integrated baffle device prevented the undesirable aggregation or fusion of POPC LNPs even for the high-lipid-concentration condition. Finally, we applied our concept to small interfering RNA (siRNA) delivery and confirmed that no significant effects due to the continuous process occurred on the siRNA encapsulation efficiency, biological distribution, and knockdown activity. The microfluidic post-treatment method is expected to contribute to the production of LNPs for practical applications and the development of novel LNP-based nanomedicines.