SARS-CoV-2 の検出のための自動分析を備えたワンステップ、ワンチューブのリアルタイム RT-PCR ベースのアッセイ

A one-step, one-tube real-time RT-PCR based assay with an automated analysis for detection of SARS-CoV-2.

• Bhasker Dharavath
• Neelima Yadav
• Sanket Desai
• Roma Sunder
• Rohit Mishra
• Madhura Ketkar
• Prasanna Bhanshe
• Anurodh Gupta
• Archana Kumari Redhu
• Nikhil Patkar
• Shilpee Dutt
• Sudeep Gupta
• Amit Dutt

抄録

SARS-CoV-2感染者の早期診断は、COVID-19パンデミックの動態を制御するために不可欠である。我々は、迅速かつ正確なワンステップマルチプレックス TaqMan プローブベースのリアルタイム RT-PCR アッセイを開発し、データを系統的に解析するための計算ツールを開発した。我々のアッセイでは、合成されたウイルス転写物とヒトの全RNAをスパイクすることによって行われた実験で、SARS-CoV-2転写物を15コピーの限界まで検出することができた。このアッセイは，26人の臨床サンプルのコホートを対象に，SARS-CoV-2遺伝子およびヒトを内部対照遺伝子として，ヒトRNAに対して1～100 ngの希釈率で184回の検証を行って評価した．26人の患者のうち5人がSARS-CoV-2に感染していることが確認されたが、21人は陰性であり、基準と一致していた。アッセイの精度は、多数の臨床サンプルを用いてさらに検証する必要がある26の臨床サンプルに基づいて、感度100％、特異度100％であることが判明した。要約すると、我々は、生の qRT-PCR データを偏りのない方法で分析するために、グラフィカルユーザーインターフェース（GUI）を備えた新しい COVID qPCR アナライザーツールを使用して自動分析を行う、迅速で実装が容易なリアルタイム PCR ベースのアッセイを提示しています、1 反応あたりのコストは 3 ドル未満、ターンアラウンドタイムは 2 時間未満で、ラボ間での SARS-CoV-2 検査を可能にします。

Early diagnosis of SARS-CoV-2 infected patients is essential to control the dynamics of the COVID-19 pandemic. We develop a rapid and accurate one-step multiplex TaqMan probe-based real-time RT-PCR assay, along with a computational tool to systematically analyse the data. Our assay could detect to a limit of 15 copies of SARS-CoV-2 transcripts-based on experiments performed by spiking total human RNA with synthesized viral transcripts. The assay was evaluated by performing 184 validations for the SARS-CoV-2 gene and human as an internal control reference gene with dilutions ranging from 1-100 ng for human RNA on a cohort of 26 clinical samples. 5 of 26 patients were confirmed to be infected with SARS-CoV-2, while 21 tested negative, consistent with the standards. The accuracy of the assay was found to be 100% sensitive and 100% specific based on the 26 clinical samples that need to be further verified using a large number of clinical samples. In summary, we present a rapid, easy to implement real-time PCR based assay with automated analysis using a novel COVID qPCR Analyzer tool with graphical user interface (GUI) to analyze the raw qRT-PCR data in an unbiased manner at a cost of under $3 per reaction and turnaround time of less than 2h, to enable in-house SARS-CoV-2 testing across laboratories.

© 2020 The Author(s).