Chelex 100 樹脂ベースの乾燥血液斑からのゲノム DNA 抽出の最適化

Optimization of Chelex 100 resin-based extraction of genomic DNA from dried blood spots.

• Neta Simon
• Jaclyn Shallat
• Corey Williams Wietzikoski
• Whitney E Harrington

抄録

乾燥血液スポット（DBS）は、普遍的な新生児スクリーニングの一環として、また、フィールドサイトからサンプルを輸送する手段として広く利用されています。我々は、アフリカの現地から採取したDBSを用いて、マイクロキメリズムと呼ばれる妊娠中の母体と胎児の細胞交換の有無を評価している。我々は、DBSから抽出された高品質のゲノムDNA（gDNA）の量を最大化するためのプロトコルを開発することを目的とした。まず、Qiagen 社のプロトコールを用いた対照 DBS と Chelex 100 樹脂を用いたプロトコールを用いた対照 DBS から得られた gDNA の総収量を比較した。その後、最適化されたプロトコールを開発するために Chelex プロトコルのバリエーションを試験した。gDNA は、ヒトβ-グロビン遺伝子を標的とした qPCR により定量した。与えられた実験条件の DNA 収量を、同じ日に実施された Chelex コントロールに正規化し、合計収量をスチューデント検定を用いて比較した。コントロール Chelex プロトコルは、QIAamp DNA ブラッドミニキットよりも 590%多くの DNA を収量しました。コントロールの Chelex プロトコルの絶対効率は 54％であったのに対し、QIAamp DNA ブラッドミニキットの絶対効率は 9％でした。同じ DBS からの 2 回目の熱沈殿を含む Chelex プロトコルの修正により、gDNA の収量は 29%増加しました（<0.001）。この変更を含む最適化されたプロトコルにより、抽出の絶対効率は68%に増加しました。Chelexプロトコルを用いて抽出したgDNAは、凍結融解を繰り返しても安定であった。模擬マイクロキメリズム実験では、最適化した Chelex プロトコルで抽出した DBS の gDNA から、10 万分の 10 の頻度で稀なドナー対立遺伝子を同定することができた。この結果は、新生児スクリーニングプログラム、遠隔地からの病原体・薬剤耐性スクリーニング、法医学、希少アレルの検出など、DBSを利用し、高品質のDNAを必要とする多様なアプリケーションに意義があると考えられます。

Dried blood spots (DBS) are widely utilized as part of universal newborn screening and as a means of transporting samples from field sites. We use DBS from African field sites to assess for rare maternal-fetal cell exchange during pregnancy known as microchimerism. We aimed to develop a protocol to maximize the quantity of high-quality genomic DNA (gDNA) extracted from DBS. The total gDNA yield obtained from control DBS utilizing a Qiagen-based protocol and a Chelex 100 resin-based protocol was first compared. Variations of the Chelex protocol were subsequently tested to develop an optimized protocol. The gDNA was quantified by qPCR targeting the human beta-globin gene. DNA yield for a given experimental condition was normalized to a Chelex control performed on the same day, and the total yields were compared using a Student's -test. The control Chelex protocol yielded 590% more DNA than the QIAamp DNA Blood Mini Kit . The absolute efficiency of the control Chelex protocol was 54%, compared to an absolute efficiency of 9% for the QIAamp DNA Blood Mini Kit. Modification of the Chelex protocol to include a second heat precipitation from the same DBS increased the gDNA yield by 29% ( < 0.001). Our optimized protocol including this modification increased the absolute efficiency of extraction to 68%. The gDNA extracted using the Chelex protocol was stable through repeated freeze-thaw cycles. In a mock microchimerism experiment, rare donor alleles at a frequency of 10 in 100 000 could be identified in gDNA from DBS extracted using the optimized Chelex protocol. Our findings may be of significance for a diverse range of applications that utilize DBS and require high-quality DNA, including newborn screening programs, pathogen and drug resistance screening from remote field sites, forensics, and rare allele detection.

© The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press.