突然変異体の死滅速度による細菌の必須プロセスの順位付け

Ranking essential bacterial processes by speed of mutant death.

• Larry A Gallagher
• Jeannie Bailey
• Colin Manoil

抄録

細菌の突然変異表現型解析は、ゲノムスケールのスクリーニング手法によって革命的に行われてきたが、必須遺伝子は、解析されたライブラリから突然変異体が欠落しているため、このような研究からは取り残されてきた。必須遺伝子は細菌の生命の最も基本的なプロセスを制御しているため、これは明らかな欠落である。この限界に対処するために、我々は必須遺伝子を含むトランスポゾン挿入変異体配列決定法を開発した。トランスフォーメーション・トランスポゾン挿入変異体シークエンシング（TFNseq）と呼ばれるこの方法は、in vitroのトランスポジションによって大きく変異誘発された染色体DNAを用いて、自然形質転換によって生成された細菌変異体の飽和レベルのライブラリを使用します。この効率的な突然変異誘発により、形質転換直後の必須遺伝子の大量の挿入を検出し、その後の生育中に失われた遺伝子を追跡することが可能になりました。その結果、45の必須プロセスを、それらの不活性化がどの程度の速さで成長を阻害するかに基づいて順序付けすることが可能となった。ATP産生、デオキシリボヌクレオチド合成、リボソーム産生を不活性化すると最も早く成長が阻害され、細胞分裂や外膜タンパク質合成を不活性化すると最も遅く成長が阻害された。必須遺伝子座の欠失した変異体は成長しない細胞のミクロコロニーを形成し、その大きさは一般的にTFNseqの順序と一致していた。遺伝子不活性化に対する必須機能の感度は、細菌の複製および増殖に対するそれらの相対的な重要性をランク付けするための指標となる。高感度な機能は、部分的に阻害しても増殖を抑えることができるため、魅力的な抗生物質の標的となり得る。

Mutant phenotype analysis of bacteria has been revolutionized by genome-scale screening procedures, but essential genes have been left out of such studies because mutants are missing from the libraries analyzed. Since essential genes control the most fundamental processes of bacterial life, this is a glaring deficiency. To address this limitation, we developed a procedure for transposon insertion mutant sequencing that includes essential genes. The method, called transformation transposon insertion mutant sequencing (TFNseq), employs saturation-level libraries of bacterial mutants generated by natural transformation with chromosomal DNA mutagenized heavily by in vitro transposition. The efficient mutagenesis makes it possible to detect large numbers of insertions in essential genes immediately after transformation and to follow their loss during subsequent growth. It was possible to order 45 essential processes based on how rapidly their inactivation inhibited growth. Inactivating ATP production, deoxyribonucleotide synthesis, or ribosome production blocked growth the fastest, whereas inactivating cell division or outer membrane protein synthesis blocked it the slowest. Individual mutants deleted of essential loci formed microcolonies of nongrowing cells whose sizes were generally consistent with the TFNseq ordering. The sensitivity of essential functions to genetic inactivation provides a metric for ranking their relative importance for bacterial replication and growth. Highly sensitive functions could represent attractive antibiotic targets since even partial inhibition should reduce growth.