プロミスカス酵素は、ラクタゾールＡへの経路で基質レベルで協力している

Promiscuous enzymes cooperate at the substrate level en route to lactazole A.

• Alexander A Vinogradov
• Morito Shimomura
• Naokazu Kano
• Yuki Goto
• Hiroyasu Onaka
• Hiroaki Suga

抄録

リボソーム的に合成され、翻訳後修飾ペプチド（RiPPs）の生合成に関与する酵素は、多くの場合、緩和された特異性プロファイルを有し、多様な基質を修飾することができる。前駆体ペプチドの成熟の間にいくつかのそのような酵素が一緒に作用すると、多数の生成物を形成することができますが、通常、生合成は単一の天然物に収束します。このようなRiPPの集合体の完全性を制御するメカニズムについては、ほとんどの場合、まだ解明されていないのが現状です。ここでは、リボソーム前駆体ペプチドから 5 つのプロミスキュラー酵素によって生成されるモデルチオペプチドであるラクタゾール A の生合成を調査します。私たちの in vitro チオペプチド生産 (FIT-Laz) システムを使用して、我々 は個々 の修飾レベルでの生合成イベントの順序を決定し、参加酵素の基質スコープ解析でこの研究を補完します。私たちの結果は、すべてのラクタゾール酵素に特徴的な最小限の基質認識要件のためにシクロデヒドレーション、デヒドロアラニン形成、アゾリン脱水素化イベントが絡み合っている珍しいが、よく定義されたアセンブリプロセスを明らかにしました。さらに、各酵素はLazBFを介したデヒドロアラニン形成を誘導する役割を果たしており、これがアセンブリープロセスの中心的なテーマとして浮上している。シクロデヒドラターゼLazDEは、アゾリン形成のための1つのセリン残基を識別し、残りの5つを潜在的なデヒドラターゼ基質として残す。ピリジン合成酵素LazCは、過脱水チオペプチドの形成を防ぐためにLazBFを運動論的に制御し、一方、脱水素とデヒドロアラニンの設置のカップリングは、過脱水生成物の生成を妨げる。以上の結果から、生合成酵素間の基質レベルでの協力がラクタゾール集合体の完全性を維持していることが明らかになった。本研究は、RiPP生合成プロセスの理解を深め、チオペプチドのバイオエンジニアリングを促進するものである。

Enzymes involved in biosynthesis of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) often have relaxed specificity profiles and are able to modify diverse substrates. When several such enzymes act together during precursor peptide maturation, a multitude of products can form, and yet usually, the biosynthesis converges on a single natural product. For the most part, the mechanisms controlling the integrity of RiPP assembly remain elusive. Here, we investigate biosynthesis of lactazole A, a model thiopeptide produced by five promiscuous enzymes from a ribosomal precursor peptide. Using our in vitro thiopeptide production (FIT-Laz) system, we determine the order of biosynthetic events at the individual modification level, and supplement this study with substrate scope analysis for participating enzymes. Our results reveal an unusual, but well-defined assembly process, where cyclodehydration, dehydroalanine formation, and azoline dehydrogenation events are intertwined due to minimal substrate recognition requirements characteristic of every lactazole enzyme. Additionally, each enzyme plays a role in directing LazBF-mediated dehydroalanine formation, which emerges as the central theme of the assembly process. Cyclodehydratase LazDE discriminates a single serine residue for azoline formation, leaving the remaining five as potential dehydratase substrates. Pyridine synthase LazC exerts kinetic control over LazBF to prevent formation of overdehydrated thiopeptides, whereas coupling of dehydrogenation to dehydroalanine installation impedes generation of underdehydrated products. Altogether, our results indicate that substrate level cooperation between the biosynthetic enzymes maintains the integrity of lactazole assembly. This work advances our understanding of RiPP biosynthesis processes and facilitates thiopeptide bioengineering.