神経細胞カルシウムセンサータンパク質のミリストイル化形態の細菌発現と精製への新規アプローチ

A Novel Approach to Bacterial Expression and Purification of Myristoylated Forms of Neuronal Calcium Sensor Proteins.

• Vasiliy I Vladimirov
• Viktoriia E Baksheeva
• Irina V Mikhailova
• Ramis G Ismailov
• Ekaterina A Litus
• Natalia K Tikhomirova
• Aliya A Nazipova
• Sergei E Permyakov
• Evgeni Yu Zernii
• Dmitry V Zinchenko

抄録

N末端ミリストイル化は、多くの真核生物やウイルスタンパク質に共通の翻訳後修飾であり、脂質やパートナータンパク質との相互作用に影響を与え、細胞内の様々なプロセスに影響を与えている。これらのタンパク質の中には、ニューロンカルシウムセンサー（NCS）タンパク質が含まれており、受信、神経伝達、神経細胞の成長、生存などの幅広い制御カスケードにおいてカルシウム信号の伝達を媒介しています。NCSの機能の詳細は、眼科疾患や神経変性疾患の進行への関与、および癌におけるその役割のために特別な関心を持っています。これまでに確立された方法では、サッカロミセス・セレビシエ由来のN-ミリストランスフェラーゼとの細菌共発現を介した組換えNCSsのネイティブライクなミリストイル化形態の調製は、しばしばミリストイル化形態と非ミリストイル化形態の混合物が得られることが多かった。ここでは、recoverin、GCAP1、GCAP2、neurocalcinδおよびNCS-1を含むいくつかのNCSを調製するための新しいアプローチを報告し、それらのほぼ完全なN-ミリストリル化を確実にする。NCSの最適化された細菌発現とミリストイル化は、疎水性相互作用クロマトグラフィーステップの組み合わせを使用して、それらのミリストイル化された形態と非ミリストイル化された形態の分離のための一連の手順に続いている。その結果、ミリストイル化されたNCS-1は、そのСа結合能と三次構造の安定性を維持していることを実証した。開発されたアプローチは、一般的に他のミリストイル化タンパク質の調製に適している。

N-terminal myristoylation is a common co-and post-translational modification of numerous eukaryotic and viral proteins, which affects their interaction with lipids and partner proteins, thereby modulating various cellular processes. Among those are neuronal calcium sensor (NCS) proteins, mediating transduction of calcium signals in a wide range of regulatory cascades, including reception, neurotransmission, neuronal growth and survival. The details of NCSs functioning are of special interest due to their involvement in the progression of ophthalmological and neurodegenerative diseases and their role in cancer. The well-established procedures for preparation of native-like myristoylated forms of recombinant NCSs via their bacterial co-expression with N-myristoyl transferase from Saccharomyces cerevisiae often yield a mixture of the myristoylated and non-myristoylated forms. Here, we report a novel approach to preparation of several NCSs, including recoverin, GCAP1, GCAP2, neurocalcin δ and NCS-1, ensuring their nearly complete N-myristoylation. The optimized bacterial expression and myristoylation of the NCSs is followed by a set of procedures for separation of their myristoylated and non-myristoylated forms using a combination of hydrophobic interaction chromatography steps. We demonstrate that the refolded and further purified myristoylated NCS-1 maintains its Са-binding ability and stability of tertiary structure. The developed approach is generally suited for preparation of other myristoylated proteins.