Tagsteady: サンプルへの配列の誤った割り当てを回避するためのメタバーコーディングライブラリ作成プロトコル

Tagsteady: a metabarcoding library preparation protocol to avoid false assignment of sequences to samples.

• Christian Carøe
• Kristine Bohmann

抄録

環境DNA（eDNA）やバルク検体から抽出されたDNAのメタバーコーディングは、生物多様性、食生活、生態学的相互作用の研究において強力なツールとなります。しかし、いわゆる「タグジャンプ」の発生は、サンプルへの配列の不適切な割り当てを引き起こし、人為的に多様性を増大させる可能性があります。5'ヌクレオチドでタグ付けされたアンプリコンのプールのライブラリー調製中の2つのステップがタグジャンプの原因となることが示唆されている。タグジャンプが発見されたことにより、タグジャンプによるサンプルへの配列の誤った割り当てが起こらないように、ツインタグを含むプライマーを用いたメタバーコーディングPCR増幅のみを実施することが推奨されるようになりました。これはコストと作業量の両方を増加させるため、タグジャンプを引き起こす2つのステップを回避するメタバーコーディングライブラリー調製プロトコルが必要とされています。ここでは、ヌクレオチドタグ付きアンプリコンのプールのためのPCRフリーのメタバーコーディングイルミナライブラリ調製プロトコルであるTagsteadyを実証しています。我々は、ツインタグ付きアンプリコンのプールを使用して、T4 DNAポリメラーゼのblunt-endingとpost-ligation PCRがタグジャンプの発生に及ぼす影響を調査し、blunt-endingとpost-ligation PCRの両方を単独または併用すると、有害な量のタグジャンプ（ここでは、全配列の約49％まで）が発生することを実証した。

Metabarcoding of environmental DNA (eDNA) and DNA extracted from bulk specimen samples is a powerful tool in studies of biodiversity, diet and ecological interactions as its inherent labelling of amplicons allows sequencing of taxonomically informative genetic markers from many samples in parallel. However, the occurrence of so-called 'tag-jumps' can cause incorrect assignment of sequences to samples and artificially inflate diversity. Two steps during library preparation of pools of 5' nucleotide-tagged amplicons have been suggested to cause tag-jumps; i) T4 DNA polymerase blunt-ending in the end-repair step and ii) post-ligation PCR amplification of amplicon libraries. The discovery of tag-jumps has led to recommendations to only carry out metabarcoding PCR amplifications with primers carrying twin-tags to ensure that tag-jumps cannot result in false assignments of sequences to samples. As this increases both cost and workload, a metabarcoding library preparation protocol which circumvents the two steps that causes tag-jumps is needed. Here, we demonstrate Tagsteady, a PCR-free metabarcoding Illumina library preparation protocol for pools of nucleotide-tagged amplicons that enables efficient and cost-effective generation of metabarcoding data with virtually no tag-jumps. We use pools of twin-tagged amplicons to investigate the effect of T4 DNA polymerase blunt-ending and post-ligation PCR on the occurrence of tag-jumps and demonstrate that both blunt-ending and post-ligation PCR, alone or together, can result in detrimental amounts of tag-jumps (here, up to ca. 49% of total sequences), while leaving both steps out (the Tagsteady protocol) results in amounts of sequences carrying new combinations of used tags (tag-jumps) comparable to background contamination.

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