日本語AIでPubMedを検索
ヒト細胞におけるコンビナトリアル遺伝学的スクリーニングのためのAsCas12aの最適化
Optimization of AsCas12a for combinatorial genetic screens in human cells.
PMID: 32661438 DOI: 10.1038/s41587-020-0600-6.
抄録
Cas12a RNA ガイドエンドヌクレアーゼは、単一の転写物として発現した複数のガイド RNA を処理し、その後標的 DNA を切断することができるため、多重化された遺伝的摂動のための有望なツールである。しかし、活性が低いことや、十分に検証されたプール型スクリーニングツールキットがないことから、Cas9をベースとした戦略に比べて普及が遅れている。本研究では、Acidaminococcus (enAsCas12a)由来の強化されたCas12aの最適化を、ヒト細胞でのプールされたコンビナトリアル遺伝学的スクリーニングのために記述します。何千ものガイドの活性をアッセイすることによって、我々は、オンターゲットのデザインルールを洗練し、プロミスキュアスガイドを予測し、除外するための包括的なオフターゲットルールのセットを開発する。また、野生型配列を置き換えることができる38の直接リピートバリアントを同定した。OVCAR8およびA375がん細胞における合成致死率のスクリーニングにより、最適化されたAsCas12aツールキットを検証し、MARCH5とWSB2の間の相互作用を発見した。最後に、enAsCas12aがゲノムワイドなドロップアウトスクリーニングにおいてCas9と同様の性能を発揮することを示すが、ライブラリサイズは大幅に縮小されており、困難なモデルでのスクリーニングを容易にするであろう。
Cas12a RNA-guided endonucleases are promising tools for multiplexed genetic perturbations because they can process multiple guide RNAs expressed as a single transcript, and subsequently cleave target DNA. However, their widespread adoption has lagged behind Cas9-based strategies due to low activity and the lack of a well-validated pooled screening toolkit. In the present study, we describe the optimization of enhanced Cas12a from Acidaminococcus (enAsCas12a) for pooled, combinatorial genetic screens in human cells. By assaying the activity of thousands of guides, we refine on-target design rules and develop a comprehensive set of off-target rules to predict and exclude promiscuous guides. We also identify 38 direct repeat variants that can substitute for the wild-type sequence. We validate our optimized AsCas12a toolkit by screening for synthetic lethalities in OVCAR8 and A375 cancer cells, discovering an interaction between MARCH5 and WSB2. Finally, we show that enAsCas12a delivers similar performance to Cas9 in genome-wide dropout screens but at greatly reduced library size, which will facilitate screens in challenging models.