RhoGEF P-Rex1の最初のDEPドメインは、活性を自己抑制し、膜結合に寄与する

The first DEP domain of the RhoGEF P-Rex1 autoinhibits activity andcontributes to membrane binding.

• Sandeep K Ravala
• Jesse B Hopkins
• Caroline B Plescia
• Samantha R Allgood
• Madison A Kane
• Jennifer N Cash
• Robert V Stahelin
• John J G Tesmer

抄録

ホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸（PIP）依存性Rac交換体1（P-Rex1）は、Rac GTPase上でGDPとGTPの交換を触媒し、それによってアクチン細胞骨格と転写の変化を誘発します。P-Rex1の過剰発現は、特定の癌の転移と高い相関があります。P-Rex1は、ヘテロ三量体Gβγサブユニット、PIP、プロテインキナーゼA（PKA）との相互作用により、細胞膜へのリクルートとその活性が制御されている。その触媒的Dbl相同性(DH)ドメインへのC末端ドメインが、自己抑制をもたらすことが、欠失解析によりさらに示されている。これらのドメインのうち、最初のディスヘベルドメイン、Egl-10およびプリークストリンドメイン（DEP1）は、構造的に特徴づけられたままである。DEP1はまた、主要なPKAリン酸化部位を有しており、この領域を理解することにより、P-Rex1シグナル伝達に関する我々の知識が大幅に向上し、新たな選択的化学療法への扉が開かれることを示唆している。ここでは、DEP1ドメイン単独では、P-Rex1のDH/PH-DEP1フラグメントの文脈で活性を自己抑制し、溶液中でDH/PHドメインと相互作用することを示す。DEP1の3.1Åの結晶構造は、以前にDvl2のDEPドメインで観察されたものと同様のドメインスワップを特徴としており、PKAサイトを含む露出した塩基性ループが関与している。精製タンパク質を用いて、DEP1リン酸化はDH/PH-DEP1フラグメントの活性や溶液中のコンフォメーションには影響を与えないが、DEP1ドメインがホスファチジン酸を含むリポソームへの結合を阻害することを示した。したがって、我々は、DEP1ドメインのPKAリン酸化が細胞内の負に帯電した膜へのP-Rex1の結合を阻害し、DEP1ドメインがDH/PHモジュールと関連し、阻害するために解放されることを提案する。

Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP)-dependent Rac exchanger 1 (P-Rex1) catalyzes the exchange of GDP for GTP on Rac GTPases, thereby triggering changes in the actin cytoskeleton and in transcription. Its overexpression is highly correlated with the metastasis of certain cancers. P-Rex1 recruitment to the plasma membrane and its activity are regulated via interactions with heterotrimeric Gβγ subunits, PIP, and protein kinase A (PKA). Deletion analysis has further shown that domains C-terminal to its catalytic Dbl homology (DH) domain confer autoinhibition. Among these, the first dishevelled, Egl-10 and pleckstrin domain (DEP1) remains to be structurally characterized. DEP1 also harbors the primary PKA phosphorylation site, suggesting that an improved understanding of this region could substantially increase our knowledge of P-Rex1 signaling and open the door to new selective chemotherapeutics. Here we show that the DEP1 domain alone can autoinhibit activity in context of the DH/PH-DEP1 fragment of P-Rex1 and interacts with the DH/PH domains in solution. The 3.1 Å crystal structure of DEP1 features a domain swap, similar to that observed previously in the Dvl2 DEP domain, involving an exposed basic loop that contains the PKA site. Using purified proteins, we show that although DEP1 phosphorylation has no effect on the activity or solution conformation of the DH/PH-DEP1 fragment, it inhibits binding of the DEP1 domain to liposomes containing phosphatidic acid. Thus, we propose that PKA phosphorylation of the DEP1 domain hampers P-Rex1 binding to negatively charged membranes in cells, freeing the DEP1 domain to associate with and inhibit the DH/PH module.

Published under license by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.