トリプトファン 2,3-ジオキシゲナーゼの触媒的三元錯体の速度論的および分光学的特性

Kinetic and spectroscopic characterization of the catalytic ternary complex of tryptophan 2,3-dioxygenase.

• Jiafeng Geng
• Andrew C Weitz
• Kednerlin Dornevil
• Michael P Hendrich
• Aimin Liu

抄録

L-トリプトファン（L-Trp）分解のためのキヌレニン経路の最初のステップは、トリプトファン2,3-ジオキシゲナーゼ（TDO）とインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）のヘム依存性ジオキシゲナーゼによって触媒される。本研究では、ストップフロー光吸収分光法を用いて、Cupriavidus metallidurans TDO (cmTDO)のミケリス錯体の速度論的挙動を調べ、L-Trpの酸素活性化と初期酸化の理解を深めた。ストップフローの結果に基づき、メスバウアー分光法を用いてこの中間体を捕捉し、その特徴を明らかにするために、急速凍結冷却(RFQ)実験を行った。高濃度の可溶化酸素を生成するために亜塩素酸ジスムターゼ-亜塩素酸系を組み込むことで、cmTDOのミケリス錯体をほぼ定量的に捕捉することができました。RFQ-メスバウアーの結果は、ミヒャエルイス錯体がO2結合鉄種であることを確認した。また、ミヒャエルイス錯体の電子状態とミオグロビンのO2付加体の電子状態の間に顕著な類似性があることを明らかにした。また、この反応性中間体の崩壊が触媒反応の律速段階であることも明らかにした。基質として(インドール-d5)-L-Trpを用いた場合、kH/kD = 0.87 ± 0.03と逆のα-2˚基質速度論的同位体効果が観測された。本研究は、バクテリアのTDOのミケリス複合体の化学的同一性について、分光学的に重要な証拠を提供するものである。

The first step of the kynurenine pathway for L-tryptophan (L-Trp) degradation is catalyzed by heme-dependent dioxygenases, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO) and indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). In this work, we employed stopped-flow optical absorption spectroscopy to study the kinetic behavior of the Michaelis complex of Cupriavidus metallidurans TDO (cmTDO) for a deeper understanding of oxygen activation and initial oxidation of L-Trp. Based on the stopped-flow results, rapid freeze-quench (RFQ) experiments were pursued to capture and characterize this intermediate by Mössbauer spectroscopy. By incorporating the chlorite dismutase-chlorite system to produce high concentrations of solubilized O2, we were able to capture the Michaelis complex of cmTDO in a nearly quantitative yield. The RFQ-Mössbauer results confirmed the identity of the Michaelis complex as an O2-bound ferrous species. They revealed remarkable similarities between the electronic properties of the Michaelis complex with those of the O2 adduct of myoglobin. We also found that the decay of this reactive intermediate is the rate-limiting step of the catalytic reaction. An inverse α-2˚ substrate kinetic isotope effect was observed with kH/kD = 0.87 ± 0.03 when (indole-d5)-L-Trp was employed as the substrate. This work provides an important piece of spectroscopic evidence on the chemical identity of the Michaelis complex of bacterial TDO.