市販のDNAポリメラーゼによる2'フルオロ修飾核酸の正確かつ効率的なワンポット逆転写および増幅

Accurate and efficient one-pot reverse transcription and amplification of 2' fluoro-modified nucleic acids by commercial DNA polymerases.

• Arianna Thompson
• Susanna Barrett
• Aurora Weiden
• Ananya Venkatesh
• Madison Seto
• Simone Gottlieb
• Aaron Morgan Leconte

抄録

DNAはバイオテクノロジーや合成生物学の基礎となるツールであるが、DNA修飾酵素に対する感度には限界がある。最近、研究者らは、DNA修飾酵素に耐性のある修飾DNA（M-DNA）の長いオリゴヌクレオチドを酵素的に合成することができるDNAポリメラーゼを同定した。ほとんどの用途では、M-DNAを逆転写し、通常はRNA逆転写酵素を用いて、配列解析やさらなる操作のために天然DNAに戻す必要があります。ここでは、市販の DNA 依存性 DNA ポリメラーゼを用いて、ワンポット反応で M-DNA の逆転写と増幅を行う能力を調べた。選ばれた6つのポリメラーゼのうち3つ（Phusion、Q5、およびDeep Vent）は、1塩基対あたり5個以下の10-3エラーで、1回の反応で合成2'FのM-DNAを逆転写および増幅することができた。さらに、2つの候補M-DNAポリメラーゼ（SFP1とSF4-6）で合成されたM-DNAをQ5 DNAポリメラーゼを用いて逆転写・増幅し、M-DNA合成時に生じるエラーの頻度、種類、位置を定量することができた。これらの研究から、SFP1はこれまでに同定された中で最も精度の高いM-DNAポリメラーゼの一つであることを明らかにした。これらの研究をまとめると、市販の材料を用いて2'FのM-DNAを1時間未満でDNAに変換するためのシンプルでロバストな方法が確立され、M-DNAの使い勝手が大幅に改善された。

DNA is a foundational tool in biotechnology and synthetic biology but is limited by sensitivity to DNA-modifying enzymes. Recently, researchers have identified DNA polymerases that can enzymatically synthesize long oligonucleotides of modified-DNA (M-DNA) that are resistant to DNA-modifying enzymes. Most applications require M-DNA to be reverse transcribed, typically using a RNA reverse transcriptase, back into natural DNA for sequence analysis or further manipulation. Here, we tested commercially available DNA-dependent DNA polymerases for their ability to reverse transcribe and amplify M-DNA in a one-pot reaction. Three of the six polymerases chosen (Phusion, Q5, and Deep Vent) were able to reverse transcribe and amplify synthetic 2'F M-DNA in a single reaction with < 5 10-3 errors per base pair. We further used Q5 DNA polymerase to reverse transcribe and amplify M-DNA synthesized by two candidate M-DNA polymerases (SFP1 and SF4-6), allowing for quantification of the frequency, types, and locations of errors made during M-DNA synthesis. From these studies, we identify SFP1 as one of the most accurate M-DNA polymerases identified to date. Collectively, these studies establish a simple, robust method for conversion of 2'F M-DNA to DNA in less than one hour using commercially available materials, significantly improving the ease of use of M-DNA.