シロイヌナズナにおける浸透圧ストレスシグナル伝達のプロファイリングのためのリン酸化プロテオミクス戦略

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis.

• Chuan-Chih Hsu
• Chia-Feng Tsai
• W Andy Tao
• Pengcheng Wang

抄録

タンパク質のリン酸化は、浸透圧条件下での酵素活性や遺伝子発現の制御に重要な役割を果たしています。質量分析(MS)ベースのリン酸化プロテオミクスは、植物のシグナル伝達の研究方法を一変させた。しかし、大量の出発物質が必要であることや、カバー範囲を広げるために長時間の測定が必要であることが、植物におけるリン酸化プロテオミクスの全体的な変化をハイスループットで研究する上での制限要因となっていました。植物リン酸化プロテオミクスの感度とスループットを向上させるために、我々は、浸透圧ストレスに応答して植物のリン酸化摂動を迅速かつ包括的に分析するためのタンデムマスタグ（TMT）ラベリングと組み合わせたストップアンドゴー抽出（ステージ）ベースのリン酸化プロテオミクスアプローチを開発しました。本研究では、ステージチップ技術の簡便性とスループットの高さを活かして、ホスホペプチドの濃縮、分画、サンプル洗浄の各ステップを2本のチップを用いて約1時間で完了させることができ、使い勝手の良さと効率の良さを実現しています。このアプローチは、植物ホスホプロテオミクスの詳細な解析（11,000個以上のホスホペプチド同定）を提供するだけでなく、隣接するフラクション間の優れた分離効率（5％以下のオーバーラップ）を実証しています。さらに、野生型およびsnrk2デカップル変異体植物のリン酸化プロテオミクス変化を定量するために、TMT標識を用いた多重化が達成されています。このアプローチは、浸透圧ストレスに応答するRaf様キナーゼのリン酸化イベントを明らかにすることに成功しており、陸上植物における初期の浸透圧シグナル伝達の理解に光を当てている。

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (> 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (< 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.