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アルギニンをベースとしたカチオン性脂質からなるsiRNAの生体適合性ナノベクターを用いたがん細胞の遺伝子ノックダウンへの応用
Biocompatible Nanovector of siRNA Consisting of Arginine-Based Cationic Lipid for Gene Knockdown in Cancer Cells.
PMID: 32657573 DOI: 10.1021/acsami.0c06273.
抄録
病原性タンパク質のノックダウン発現を介した治療薬としてsiRNA（small interfering RNA）が使用されているにもかかわらず、そのようなsiRNAの細胞内への輸送および送達については研究が続けられています。非ウイルスベクター内では、アミノ酸残基を構造中に含むカチオン性脂質や、プラスミドDNAナノキャリアとしての適性が既に実証されているsiRNAビヒクルも検討されています。本研究では、アミノ酸アルギニンとヘルパー脂質を混合した二本鎖カチオン性脂質を対象とした生物物理学的研究を行った。まず、ゼータ電位測定とアガロースゲル電気泳動実験によりsiRNAの圧縮を確認し、小角X線散乱解析（SAXS）によりリポプレックスの構造パターンを明らかにした。その結果、2つの連続した立方体相が共存していることが判明しました：ダブルジロイド相（）とダブルダイヤモンド相（）です。第二に、HeLa-GFPおよびT731-GFP細胞株（GFP過剰発現のために改変された）における研究は、中等度から高レベルの遺伝子ノックダウンレベル（フローサイトメトリーおよびエピ蛍光顕微鏡によって決定される）を示し、顕著な細胞生存率（CCK8アッセイ）を示した。最後に、ナノ液体クロマトグラフィー/質量分析法（nanoLC-MS/MS）を用いて、ヒト血清とのインキュベーション後にリポプレックス表面に付着したタンパク質の性質を同定し、生体液中での挙動をシミュレートした。本研究では、リポプレックスの表面に付着したタンパク質の性質を明らかにするために、リポプレックスの表面に付着したタンパク質の性質を明らかにした。ここで報告された結果は、細胞トランスフェクションプロセスでDNAプラスミドナノキャリアとして既に良好な結果をもたらしているアミノ酸ベースのカチオン性脂質と適切なヘルパー脂質との混合物の使用もまた、生体適合性のオプションである可能性があることを示しているが、これまでのところほとんど研究されていない遺伝子サイレンシング戦略である。
Despite the use of small interfering RNAs (siRNAs) as therapeutic agents through the knockdown expresion of pathogenic proteins, the transportation and delivery of such siRNAs into cells continues under investigation. Within non-viral vectors, cationic lipids that include amino acid residues in their structures, and that have already demonstrated their suitability as plasmid DNA nanocarriers, may be also considered as potential siRNA vehicles. A double-chain cationic lipid based on the amino acid arginine mixed with a helper lipid, has been the object of this biophysical study. Firstly, zeta potential measurements and agarose gel electrophoresis experiments confirmed the siRNA compaction, while small-angle X-ray scattering analysis (SAXS) revealed the structural pattern of the lipoplexes. Two bicontinuous cubic phases were found to coexist: the double-gyroid phase () and the double-diamond phase (), with and as crystallographic space groups, respectively; the siRNA is known to be located inside their bicontinuous aqueous channels. Secondly, studies in HeLa-GFP and T731-GFP cell lines (modified for GFP overexpression) showed moderate-to-high gene knockdown levels (determined by flow cytometry and epifluorescence microscopy) with remarkable cell viabilities (CCK8 assay). Finally, nano-liquid chromatography/mass spectrometry (nanoLC-MS/MS) was used to identify the nature of the proteins adhered to the surface of the lipoplexes after incubation with human serum, simulating their behavior in biological fluids. The abundant presence of lipoproteins and serum albumin in such protein corona, together with the coexistence of the bicontinuous cubic phases, may be behind the remarkable silencing activity of these lipoplexes. The results reported herein show that the use of amino acid-based cationic lipids mixed with a suitable helper lipid, which have already provided good results as DNA plasmid nanocarriers in cellular transfection processes, may also be a biocompatible option, and so far little investigated, in gene silencing strategies.