メタゲノム研究のための糞便DNA抽出プロトコルの評価

Assessment of fecal DNA extraction protocols for metagenomic studies.

• Fangming Yang
• Jihua Sun
• Huainian Luo
• Huahui Ren
• Hongcheng Zhou
• Yuxiang Lin
• Mo Han
• Bing Chen
• Hailong Liao
• Susanne Brix
• Junhua Li
• Huanming Yang
• Karsten Kristiansen
• Huanzi Zhong

抄録

背景:

ショットガンによるメタゲノムシークエンシングは、ヒトの腸内細菌叢の理解を向上させてきました。様々な DNA 抽出方法が比較され、元の微生物群集構造を堅牢かつ最も正確に反映するプロトコルが見出されています。しかし、これらの推奨事項は、非常に大規模なヒトコホートからのサンプルを扱う際に必要な時間とコストを考慮することで、さらに洗練されたものになります。さらに、真菌のDNA抽出性能については、これまでのところほとんど調査されていない。

BACKGROUND: Shotgun metagenomic sequencing has improved our understanding of the human gut microbiota. Various DNA extraction methods have been compared to find protocols that robustly and most accurately reflect the original microbial community structures. However, these recommendations can be further refined by considering the time and cost demands in dealing with samples from very large human cohorts. Additionally, fungal DNA extraction performance has so far been little investigated.

結果:

MagPure Fast Stool DNA KF Kit B、Macherey Nagel™ NucleoSpin™®Soil kit、Zymo Research Quick-DNA™の6種類のDNA抽出プロトコールを比較しました。糞便/土壌微生物キット、MOBIO DNeasy PowerSoilキット、マニュアルの非商用プロトコールMetaHIT、そして最近発表されたプロトコールQでは、1つの微生物モックコミュニティ（MMC）（8つの細菌株と2つの真菌株を含む）と糞便サンプルを使用しています。すべてのサンプルを手作業で抽出し、ショットガンメタゲノミクスシークエンスを行った。DNA 抽出の結果、6 つのプロトコルすべてにおいて高い再現性が確認されたが、微生物の抽出効率にはばらつきがあった。MMC の結果から、ビーズの大きさが真菌および細菌の DNA 収量を決定する要因であることが示されました。ヒトの糞便サンプルでは、MagPure細菌抽出は標準化されたプロトコルQと同様に実行されましたが、より速く、より費用対効果の高いものでした。PowerSoilプロトコルを用いた抽出では、他のプロトコルよりもグラム陰性菌とグラム陽性菌の比率が有意に高く、健康な成人の間で報告されている腸内微生物の違いに寄与している可能性がある。

RESULTS: We compared 6 DNA extraction protocols, MagPure Fast Stool DNA KF Kit B, Macherey Nagel™ NucleoSpin™®Soil kit, Zymo Research Quick-DNA™ Fecal/Soil Microbe kit, MOBIO DNeasy PowerSoil kit, the manual non-commercial protocol MetaHIT, and the recently published protocol Q using 1 microbial mock community (MMC) (containing 8 bacterial and 2 fungal strains) and fecal samples. All samples were manually extracted and subjected to shotgun metagenomics sequencing. Extracting DNA revealed high reproducibility within all 6 protocols, but microbial extraction efficiencies varied. The MMC results demonstrated that bead size was a determining factor for fungal and bacterial DNA yields. In human fecal samples, the MagPure bacterial extraction performed as well as the standardized protocol Q but was faster and more cost-effective. Extraction using the PowerSoil protocol resulted in a significantly higher ratio of gram-negative to gram-positive bacteria than other protocols, which might contribute to reported gut microbial differences between healthy adults.

結論:

我々は、細菌および真菌のDNA抽出におけるビーズサイズの選択の重要性を強調している。さらに重要なことは、新しいプロトコルMPの性能は、推奨されている標準化されたプロトコルQの性能と一致していたが、消費時間が短く、より費用対効果が高く、さらに大規模なヒト腸内メタゲノム研究に推奨されていることである。

CONCLUSIONS: We emphasize the importance of bead size selection for bacterial and fungal DNA extraction. More importantly, the performance of the novel protocol MP matched that of the recommended standardized protocol Q but consumed less time, was more cost-effective, and is recommended for further large-scale human gut metagenomic studies.

© The Author(s) 2020. Published by Oxford University Press.