セロトニントランスポーターのアロステリックに結合した結合部位が単一分子力覚分光法によって明らかにされた

Allosterically Linked Binding Sites in Serotonin Transporter Revealed by Single Molecule Force Spectroscopy.

• Rong Zhu
• Walter Sandtner
• Joan E A Ahiable
• Amy Hauck Newman
• Michael Freissmuth
• Harald H Sitte
• Peter Hinterdorfer

抄録

神経伝達物質/ナトリウムシンポーター(NSS)のリガンド結合部位については、分子薬理学の手法を用いた結晶構造や実験では相反する結果が報告されている。私たちは、原子間力顕微鏡(AFM)を用いた新しいツールを設計することで、生理的環境下での神経伝達物質/ナトリウムシンポーターのリガンド結合部位の数と機能性を探りました。これにより、セロトニントランスポーター（SERT）と抗うつ薬S-シタロプラム（S-CIT）との間の相互作用力を1分子レベルで直接測定することが可能となった。チップの化学的性質は、CHO細胞での特異的な力の測定と認識イメージングによって検証された。SERTへのS-CIT結合の特徴的な結合強度の2つの異なる集団が、Naを含むバッファーで明らかになった。対照的に、Liを含むバッファーでは、SERTは低い力の相互作用のみを示した。逆に、前庭変異体SERT-G402Hは、単に高い力の集団を示しただけであった。これらの観察は、SERTに2つの結合部位が存在することの物理的証拠を提供する。力探査実験のダイナミクスを変化させることにより、両結合部位の解離速度定数を抽出した。競合実験の結果、2つの結合部位はアロステリックに結合しており、相互に変調を及ぼしていることが明らかになった。

Crystal structures and experiments relying on the tools of molecular pharmacology reported conflicting results on ligand binding sites in neurotransmitter/sodium symporters (NSS). We explored the number and functionality of ligand binding sites of NSS in a physiological setting by designing novel tools for atomic force microscopy (AFM). These allow for directly measuring the interaction forces between the serotonin transporter (SERT) and the antidepressant S-citalopram (S-CIT) on the single molecule level: the AFM cantilever tips were functionalized with S-CIT via a flexible polyethylene glycol (PEG) linker. The tip chemistry was validated by specific force measurements and recognition imaging on CHO cells. Two distinct populations of characteristic binding strengths of S-CIT binding to SERT were revealed in Na-containing buffer. In contrast, in Li-containing buffer, SERT showed only low force interactions. Conversely, the vestibular mutant SERT-G402H merely displayed the high force population. These observations provide physical evidence for the existence of two binding sites in SERT. The dissociation rate constant of both binding sites was extracted by varying the dynamics of the force-probing experiments. Competition experiments revealed that the two sites are allosterically coupled and exert reciprocal modulation.

Copyright © 2020 Zhu, Sandtner, Ahiable, Newman, Freissmuth, Sitte and Hinterdorfer.