左心低形成症候群に関連した頭部ドメイン変異を有する誘導多能性幹細胞心筋細胞の収縮性

Contractility of Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocytes With an Head Domain Variant Associated With Hypoplastic Left Heart Syndrome.

• Min-Su Kim
• Brandon Fleres
• Jerrell Lovett
• Melissa Anfinson
• Sai Suma K Samudrala
• Lauren J Kelly
• Laura E Teigen
• Matthew Cavanaugh
• Maribel Marquez
• Aron M Geurts
• John W Lough
• Michael E Mitchell
• Robert H Fitts
• Aoy Tomita-Mitchell

抄録

左心低形成症候群（HLHS）は、臨床的にも解剖学的にも重篤な先天性心疾患であるが、その病因はほとんどわかっていない。我々はこれまでに、この遺伝子の遺伝子変異がHLHSと有意に関連していることを明らかにしてきた。さらに、6-R443Pヘッドドメインの変異を持つHLHS患者の親、非親、子孫から得た多能性幹細胞由来心筋細胞（iPSC-CMs）を用いて、サルコメア構造の不定形化と代償性発現の亢進を明らかにしました。HLHSトリオ由来のiPSC-CMを解析したところ、分化15日目(D15)以降、-R443P変異体を持つCMではβミオシン重鎖発現のみが観察された。D20からD23の間に行われた機能評価では、-R443P変異体CMはよりゆっくりと収縮し（40±2 vs. 47±2収縮/分、<0.05）、短縮し（5.6±0.5 vs. 8.1±0.0.細胞長の7％、<0.05）、より遅い短縮速度（19.9±1.7 vs. 28.1±2.5μm/s、<0.05）および緩和速度（11.0±0.9 vs. 19.7±2.0μm/s、<0.05）を示した。イソプロテレノールによる処置は、iPSC-CM力学に影響を及ぼさなかった。CRISPR/Cas9遺伝子編集技術を用いて、影響を受けていない親のiPSCにR443P変異体を導入することで、子孫のiPSC-CMの表現型を再現し、逆に、子孫のiPSCにR443P変異体を修正することで、心筋分化、サルコメア組織、より遅い収縮（<0.05）、および速度低下の表現型（<0.0001）を回復させた。これは、HLHS患者の心臓組織が心房組織ではサルコメア組織の乱れを示すが、心室組織では示さないことを明らかにした最初の報告である。この新しい発見は予想外のものではなかった。これらの知見は、患者由来のiPSC-CMsを患者の心臓組織と組み合わせて使用することで、遺伝的変異がHLHSにどのようにつながるかについての機序的な洞察を得ることが可能であることを示している。本研究の結果は、心房内のサルコメアの乱れによるCMの収縮力の低下が、正常な左心室の発達を妨げる血行動態の変化に影響を与える可能性を示唆している。

Hypoplastic left heart syndrome (HLHS) is a clinically and anatomically severe form of congenital heart disease; however, its etiology remains largely unknown. We previously demonstrated that genetic variants in the gene are significantly associated with HLHS. Additionally, induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) from an HLHS-affected family trio (affected parent, unaffected parent, affected proband) carrying an 6-R443P head domain variant demonstrated dysmorphic sarcomere structure and increased compensatory expression. Analysis of iPSC-CMs derived from the HLHS trio revealed that only beta myosin heavy chain expression was observed in CMs carrying the -R443P variant after differentiation day 15 (D15). Functional assessments performed between D20-D23 revealed that -R443P variant CMs contracted more slowly (40 ± 2 vs. 47 ± 2 contractions/min, < 0.05), shortened less (5.6 ± 0.5 vs. 8.1 ± 0.7% of cell length, < 0.05), and exhibited slower shortening rates (19.9 ± 1.7 vs. 28.1 ± 2.5 μm/s, < 0.05) and relaxation rates (11.0 ± 0.9 vs. 19.7 ± 2.0 μm/s, < 0.05). Treatment with isoproterenol had no effect on iPSC-CM mechanics. Using CRISPR/Cas9 gene editing technology, introduction of the R443P variant into the unaffected parent's iPSCs recapitulated the phenotype of the proband's iPSC-CMs, and conversely, correction of the R443P variant in the proband's iPSCs rescued the cardiomyogenic differentiation, sarcomere organization, slower contraction ( < 0.05) and decreased velocity phenotypes ( < 0.0001). This is the first report to identify that cardiac tissues from HLHS patients with variants can exhibit sarcomere disorganization in atrial but not ventricular tissues. This new discovery was not unexpected, since is expressed predominantly in the postnatal atria in humans. These findings demonstrate the feasibility of employing patient-derived iPSC-CMs, in combination with patient cardiac tissues, to gain mechanistic insight into how genetic variants can lead to HLHS. Results from this study suggest that decreased contractility of CMs due to sarcomere disorganization in the atria may effect hemodynamic changes preventing development of a normal left ventricle.

Copyright © 2020 Kim, Fleres, Lovett, Anfinson, Samudrala, Kelly, Teigen, Cavanaugh, Marquez, Geurts, Lough, Mitchell, Fitts and Tomita-Mitchell.