炭素代謝と窒素代謝の分岐点に位置する重要な酵素、グルタミン酸脱水素酵素（Isoform 1）の構造研究

Structural Studies of Glutamate Dehydrogenase (Isoform 1) From , an Important Enzyme at the Branch-Point Between Carbon and Nitrogen Metabolism.

• Marta Grzechowiak
• Joanna Sliwiak
• Mariusz Jaskolski
• Milosz Ruszkowski

抄録

グルタミン酸脱水素酵素(GDH)は、NAD(P)依存性のグルタミン酸の可逆的な酸化的脱離によりアンモニアを放出し、2-オキソグルタル酸(2OG)を生成します。現在の認識では、GDHはGluの恒常性に寄与し、炭素と窒素の同化経路の接合部で重要な役割を果たしています。GDHは、ELFV（Glu/Leu/Phe/Val）アミノ酸デヒドロゲナーゼのスーパーファミリーのメンバーであり、補酵素特異性に基づいて、3つのサブクラスに細分化されています。NAD特異的、NAD/NADP二重特異的、NADP特異的である。本研究では、ミトコンドリアのGDH1アイソザイムがNAD特異的であることを明らかにした。また、ミトコンドリアを標的とした３つのGDHアイソザイム（GDH1-3）を発現し、そのうちGDH2は余分なEF-ハンドモチーフを持ち、カルシウムによって刺激されることを明らかにした。GDH1-3は様々な組成のホモ・ヘテロヘキサマーを形成している。我々は、組換え体GDH1のアポ型とNADとの複合体の結晶構造を、それぞれ2.59Åと2.03Åの分解能で解析した。また、アポ型およびNADとの1:1の複合体において、GDH1は対称性のあるホモヘキサマーを形成していることを示した。GDH1のサブユニットは、六量体形成と基質結合に関与するドメインIと、補酵素を結合するドメインIIから構成されている。GDH1-NAD六量体のサブユニットの一つは、活性部位にセレンディピタス2OG分子を含み、ドメインの劇的な(約25°)閉鎖を引き起こしている。我々は、ドメインIに先行するN末端ペプチドがミトコンドリアターゲティングシグナルであり、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ(MPP)の予想される切断部位がLeu17-Leu18にあり、それには予想外のカリウム配位部位(Ser27, Ile30)が続いているという説得力のある証拠を提供する。また、保存された配列を有するいくつかのMPD[(+/-)-2-メチル-2,4-ペンタンジオール]結合部位を同定した。GDH1は、我々のアッセイではMPDに対して鈍感であるが、ドラッグ可能な部位の観察は、非競合的な除草剤設計のための可能性を開く。

Glutamate dehydrogenase (GDH) releases ammonia in a reversible NAD(P)-dependent oxidative deamination of glutamate that yields 2-oxoglutarate (2OG). In current perception, GDH contributes to Glu homeostasis and plays a significant role at the junction of carbon and nitrogen assimilation pathways. GDHs are members of a superfamily of ELFV (Glu/Leu/Phe/Val) amino acid dehydrogenases and are subdivided into three subclasses, based on coenzyme specificity: NAD-specific, NAD/NADP dual-specific, and NADP-specific. We determined in this work that the mitochondrial GDH1 isozyme from is NAD-specific. Altogether, expresses three GDH isozymes (GDH1-3) targeted to mitochondria, of which GDH2 has an extra EF-hand motif and is stimulated by calcium. Our enzymatic assays of GDH1 established that its sensitivity to calcium is negligible. the GDH1-3 enzymes form homo- and heterohexamers of varied composition. We solved the crystal structure of recombinant GDH1 in the apo-form and in complex with NAD at 2.59 and 2.03 Å resolution, respectively. We demonstrate also that both in the apo form and in 1:1 complex with NAD, it forms -symmetric homohexamers. A subunit of GDH1 consists of domain I, which is involved in hexamer formation and substrate binding, and of domain II which binds coenzyme. Most of the subunits in our crystal structures, including those in NAD complex, are in open conformation, with domain II forming a large (albeit variable) angle with domain I. One of the subunits of the GDH1-NAD hexamer contains a serendipitous 2OG molecule in the active site, causing a dramatic (∼25°) closure of the domains. We provide convincing evidence that the N-terminal peptide preceding domain I is a mitochondrial targeting signal, with a predicted cleavage site for mitochondrial processing peptidase (MPP) at Leu17-Leu18 that is followed by an unexpected potassium coordination site (Ser27, Ile30). We also identified several MPD [(+/-)-2-methyl-2,4-pentanediol] binding sites with conserved sequence. Although GDH1 is insensitive to MPD in our assays, the observation of druggable sites opens a potential for non-competitive herbicide design.

Copyright © 2020 Grzechowiak, Sliwiak, Jaskolski and Ruszkowski.