PSEN1 の A246E 変異を有する iPSC 由来神経細胞を用いた三次元アルツハイマー病細胞培養モデル

A Three-Dimensional Alzheimer's Disease Cell Culture Model Using iPSC-Derived Neurons Carrying A246E Mutation in PSEN1.

• Mercedes A Hernández-Sapiéns
• Edwin E Reza-Zaldívar
• Ricardo R Cevallos
• Ana L Márquez-Aguirre
• Karlen Gazarian
• Alejandro A Canales-Aguirre

抄録

アルツハイマー病（AD）は、主にアミロイドβ（Aβ）の細胞外沈着と高リン酸化タウタンパク質の細胞内蓄積によって引き起こされる進行性の知的衰退と記憶、神経細胞の損失を特徴とする慢性的な脳疾患であり、主に前頭前野や海馬などの記憶や学習に関与する領域で発生します。ADの2つの形態があります、65歳以上の人々に影響を与える遅発型と遺伝性と影響を与える早期発症型は、早期年齢〜45歳で人々に影響を与えます。現在までのところ、この病気の治療法はありません; その結果、病気に関与するプロセスの研究のための新しいツールを開発することが不可欠です。現在、人工多能性幹細胞（iPSC）由来の神経細胞を用いたADの3次元（3D）モデルは、より生理学的に関連性の高い情報や検査の予測データを提供するという潜在的な利点から、疾患モデル化の地平を広げ、機構論的研究や前臨床創薬への関心を集めています。そこで本研究では、A246E変異を有するiPSCsを用いたADの3次元細胞培養モデルを確立することを目的とした。我々は、PSEN1遺伝子のA246E変異を有するAD患者の線維芽細胞からヒトiPSCsを生成した。細胞の再プログラミングは、山中の因子（OSKM：Oct4、Sox2、Klf4、およびc-Myc）を有するレンチウイルスベクターを用いて行われた。得られたiPSCは、多能性遺伝子、アルカリホスファターゼ活性、多能性幹細胞マーカー（OCT4, SOX2, TRA-1-60, SSEA4）を発現しており、二重SMAD阻害により三次元環境下での神経系への分化能を示した。これらのiPSC由来の神経細胞はAβオリゴマーを保有しており、ウエスタンブロット（WB）および免疫染色により確認された。ヒトiPSC由来のニューロンがAβオリゴマーを産生できることから、突然変異誘導や合成Aβ曝露を必要とせずにAβ凝集を再現できる、新しいヒトハイドロゲルベースの3次元細胞培養モデルを確立した。このモデルを用いることで、脳内の病気の広がりに関与するプロセスの研究、治療効果のある分子や化合物のスクリーニング、個別化された治療戦略の開発が可能になると考えられます。

Alzheimer's disease (AD) is a chronic brain disorder characterized by progressive intellectual decline and memory and neuronal loss, caused mainly by extracellular deposition of amyloid-β (Aβ) and intracellular accumulation of hyperphosphorylated tau protein, primarily in areas implicated in memory and learning as prefrontal cortex and hippocampus. There are two forms of AD, a late-onset form that affects people over 65 years old, and the early-onset form, which is hereditable and affect people at early ages ~45 years. To date, there is no cure for the disease; consequently, it is essential to develop new tools for the study of processes implicated in the disease. Currently, AD three-dimensional (3D) models using induced pluripotent stem cells (iPSC)-derived neurons have broadened the horizon for disease modeling and gained interest for mechanistic studies and preclinical drug discovery due to their potential advantages in providing a better physiologically relevant information and more predictive data for tests. Therefore, this study aimed to establish a 3D cell culture model of AD using iPSCs carrying the A246E mutation. We generated human iPSCs from fibroblasts from a patient with AD harboring the A246E mutation in the PSEN1 gene. Cell reprogramming was performed using lentiviral vectors with Yamanaka's factors (OSKM: Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc). The resulting iPSCs expressed pluripotency genes (such as and ), alkaline phosphatase activity, and pluripotency stem cell marker expression, such as OCT4, SOX2, TRA-1-60, and SSEA4. iPSCs exhibited the ability to differentiate into neuronal lineage in a 3D environment through dual SMAD inhibition as confirmed by Nestin, MAP2, and Tuj1 neural marker expression. These iPSC-derived neurons harbored Aβ oligomers confirmed by Western Blot (WB) and immunostaining. With human iPSC-derived neurons able to produce Aβ oligomers, we established a novel human hydrogel-based 3D cell culture model that recapitulates Aβ aggregation without the need for mutation induction or synthetic Aβ exposure. This model will allow the study of processes implicated in disease spread throughout the brain, the screening of molecules or compounds with therapeutic potential, and the development of personalized therapeutic strategies.

Copyright © 2020 Hernández-Sapiéns, Reza-Zaldívar, Cevallos, Márquez-Aguirre, Gazarian and Canales-Aguirre.