本研究では、UPLC-Q/TOF-MSメタボロミクスを用いて、薬用植物Phellodendri Amurensis cortexのドキソルビシン誘発性腎炎ラットに対する作用機序の解明に向けて、代謝物と代謝経路の変化を明らかにしました

Characterizing metabolites and potential metabolic pathways changes to understanding the mechanism of medicinal plant Phellodendri Amurensis cortex against doxorubicin-induced nephritis rats using UPLC-Q/TOF-MS metabolomics.

• Hongcai Zhang
• Shuxiang Zhang
• Wenran Wang
• Qi Wang
• Haixue Kuang
• Qiuhong Wang

抄録

漢方薬として有名なPhellodendri Amurensis cortex (PAC)は、優れた抗炎症作用を持つ漢方薬であり、臨床現場では様々な肝腎疾患の治療に使用されています。しかし、PACの腎炎を予防する潜在的なメカニズムは、これまで包括的には解明されていませんでした。本研究の目的は、代謝物と潜在的な代謝経路の変化を明らかにすることで、ドキソルビシンによるラットの腎炎に対するPACのメカニズムを探ることである。ラットの腎炎モデルは、尾静脈から6.5mg/kgのドキソルビシンを5週間投与した。投与群のラットには、実験期間中、それぞれPAC抽出物を216、432、864mg/kgの用量で1日1回投与した。その後、超高性能液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間-タンデム質量分析法（UPLC-Q/TOF-MS）を用いた尿メタボロミクス法を用いて、腎炎ラットの有意な代謝物と代謝経路を明らかにした。実験終了後、血清、尿及び腎臓組織を採取し、生化学的及び病理学的検査を行った。その結果、PAC 投与により、尿蛋白質、血清 Cr 含量、腎組織病変が顕著に減少し、血清 TP および ALB 含量が増加することが示された。腎炎ラットモデルに寄与する5'-メチルチオアデノシン、cGMP、デヒドロエピアンドロステロン硫酸、サルブタ、2-フェニルアミノアデノシンなど、合計28種類の潜在的な代謝物を選択し、尿サンプルから同定した。その結果、モデル群と比較して、高用量PAC群では18種類の代謝物が、中用量PAC群では13種類の代謝物が、低用量PAC群では8種類の代謝物が確認でき、ステロイドホルモン生合成、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸代謝、システイン、メチオニン代謝、グリオキシル酸、ジカルボキシル酸代謝など9つの主要代謝経路に関与していた。さらに、メチルチオアデノシンホスホリラーゼ（Mtap）、シチジンデアミナーゼ（Cda）、チミジンキナーゼ（Tk）、アルギニノスクシネート合成酵素（Ass）の代謝経路に関与する主要な酵素のタンパク質発現をウェスタンブロットで検証した。その結果、Phellodendron chinense は Cda と Tk の発現を上昇させ、Mtap と Ass の発現を低下させた。結論として、PAC はドキソルビシン誘発性腎炎に対する腎保護効果を有しており、それは微分代謝物の調節、酸化ストレス応答の低減、腎機能の改善、免疫系の機能強化、重要な酵素の役割の調節を介している可能性がある。

Phellodendri Amurensis cortex (PAC), a famous traditional Chinese herb with good anti-inflammatory efficacy, is used to treat various liver and kidney sickness in clinical practice. However, the potential mechanisms protecting against nephritis of PAC have not been comprehensively elucidated. The aim of this research was to explore the mechanism of PAC against doxorubicin- induced nephritis in rats by characterizing metabolites and potential metabolic pathways changes. The rat models of nephritis were established using 6.5 mg/kg doxorubicin injection from caudal vein for five weeks. The rats in the treatment group were respectively received PAC extract at the dose of 216, 432, and 864 mg/kg once a day during the experiment. Then, urine metabolomics strategy based on ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight-tandem mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) has been employed to discover the possible significant metabolites and metabolic pathway of nephritis rats. At the end of the experiment, serum, urine and kidney tissue were collected for biochemical and pathological examination. The results showed that PAC treatment notably decreased urinary protein, serum Cr content and renal tissue lesions, and increased serum TP and ALB content. A total of potential twenty- eight metabolites such as 5'-methylthioadenosine, cGMP, dehydroepiandrosterone sulfate, salbuta, 2-phenylaminoadenosine contributing to nephritis rat model were selected and identified in the urine samples. Compared with the model group, the high-dose PAC group can recall 18 metabolites level, the medium-dose group can recall 13 metabolites level, and the low-dose PAC group can recall 8 metabolites level, which were involved in nine primary metabolic pathways such as steroid hormone biosynthesis, alanine,aspartate and glutamate metabolism, cysteine and methionine metabolism as well as glyoxylate and dicarboxylate metabolism. The protein expressions of key enzymes involving methylthioadenosine phosphorylase (Mtap), cytidine deaminase (Cda), thymidine kinase (Tk), argininosuccinate synthase (Ass) in metabolic pathways were further verified by Western blot. The results showed that Phellodendron chinense up-regulated the protein expressions of Cda and Tk and down-regulated the protein expressions of Mtap and Ass. In conclusion, PAC possesses renoprotective effect against doxorubicin-induced nephritis, which may be mediated via regulating differential metabolites, reducing oxidative stress response, improving renal function, enhancing the ability of the immune system, regulating the role of key enzymes.

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