深層共晶溶媒がチトクロームP450酵素の生合成・有機合成における触媒機能を高める仕組み

Mechanism of deep eutectic solvents enhancing catalytic function of cytochrome P450 enzymes in biosynthesis and organic synthesis.

• Haifeng Sun
• Rui Xin
• Danhua Qu
• Fang Yao

抄録

インディゴは不溶性の青色染料であり、その製造過程で深刻な公害を発生させています。そのため、より環境に配慮した高効率な藍の生合成が注目されています。そこで、本研究では、藍を生産するためのインドール触媒であるシトクロムP45-BM-3に対する様々な深層共晶溶媒(DES)の役割を明らかにすることを目的とした。DESは加熱撹拌により合成した。核磁気共鳴(NMR)及びフーリエ変換赤外スペクトル(FT-IR)により溶媒の構造を解析し、溶媒の粘度、密度及び屈折率と溶媒の含水率との関係を調べた。酵素タンパク質の三次構造の検出には、円形二色性分光計を用いた。また、P450 BM-3の触媒活性と安定性に及ぼす溶媒の種類、濃度、pH、温度、含水率の影響を紫外分光光度計を用いて測定した。ＤＥＳとバッファーを用いた新しい溶媒二相系を確立し、組換え大腸菌バイオ触媒化インドールを用いてインジゴを調製した。DESは、水素結合を介した成分間の分子間相互作用により形成される低融点共晶である。DESの密度，粘度，屈折率などの物性は，溶媒の含水率，温度によって変化した。また、DESのpH,含水率,温度は、P450 BM-3の触媒活性と正の相関があった。以上のことから、DESはP450 BM-3の触媒活性と熱安定性を向上させることが可能であることがわかった。インディゴは、DESとバッファーの二相性システムを用いて効率的に調製することが可能である。

Indigo is an insoluble blue dye, which generates serious pollution in its production process. Increasing focus has come to the biosynthesis of indigo that are more environment-preserved and high-efficient. Hence, this study was designed to explore the specific role of various deep eutectic solvents (DESs) on cytochromeP45-BM-3 catalyzing indole to produce indigo. DESs were synthesized by heating and stirring. The structure of the solvent was analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR) and fourier transform infrared spectrum (FT-IR), and the relationship between the viscosity, density and refractive index of the solvent, and the water content of the solvent was examined. Circular dichroism spectrometer was used to detect the tertiary structure of the enzyme protein. The effect of solvent type, concentration, pH, temperature, and water content on the catalytic activity and stability of P450 BM-3 was measured using an ultraviolet spectrophotometer. A new solvent biphasic system was established using DESs and buffers, and indigo was prepared using recombinant E. coli-biocatalyzed indole. DESs were low-melting eutectics formed by molecules interaction of components through hydrogen bonding. The physical properties of DESs such as density, viscosity, and refractive index varied with water content and temperature of the solvent. The pH, water content, and temperature of DESs were positively correlated with the catalytic activity of P450 BM-3. To sum up, DESs can improve the catalytic activity and thermal stability of P450 BM-3. Indigo can be efficiently prepared using the DESs-buffer biphasic system.

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