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リアルタイムPCRとインシリコ遺伝学的評価を用いて、アミノ酸パーミターゼ3とチトクロームオキシダーゼII遺伝子を標的としたリーシュマニア種の正確な同定のための高分解能融解技術の設計と開発を行っている
Designing and developing a high-resolution melting technique for accurate identification of Leishmania species by targeting amino acid permease 3 and cytochrome oxidase II genes using real-time PCR and in silico genetic evaluation.
PMID: 32652055 DOI: 10.1016/j.actatropica.2020.105626.
抄録
リーシュマニア寄生虫の正確な同定には、識別、正確な同定、信頼性の高い技術が必要です。高分解能融解法（HRM）は、本格的で正確な方法として認識されている。本研究の主な目的は、Leishmania major、Leishmania tropica、およびミックス感染症の検出とスクリーニングのためにHRM分析を最適化することであった。リーシュマニア寄生虫のDNAサンプル36個を調製し、解析を行った。アミノ酸浸透酵素3（AAP3）とチトクローム酸化酵素II（COII）の2つの遺伝子領域を標的とし、6組の特異的な新規プライマーを設計した。バイオインフォマティクス解析を用いて、各種のDNA温度分解能を予測し、インビトロ結果と比較した。選択した遺伝子領域の遺伝的多様性は、PCR-sequencing法とDnaSP 5.10.01ソフトウェアを用いて解析した。これらの遺伝子領域はGenBankに登録されている（KU680818-KU680821、KY041643-KY041649）。AAP3遺伝子のハプロタイプ多様性は96％、COII遺伝子のハプロタイプ多様性は87％であった。田島のD指数はAAP3で0.65、COIIで0.36であった。CLC Genomics Workbench 11ソフトウェアの予測は有意であり、これらの知見に近いものであった。設計されたプライマーは、少なくとも2種のリーシュマニアを同定することができた。HRM法の温度変化により、イランのLeishmania寄生虫はL. major, L. tropica, mix感染症の3種に分離された。その結果、本手法が臨床・実験環境の両方で有用であることが明らかになった。また、HRM法は、ヒト、リザーバー宿主、ベクターなどの異なる宿主におけるリーシュマニア寄生虫の検出にも有効であることが明らかになった。実際、HRMはリーシュマニアの同定技術としてだけでなく、生態学的・疫学的研究にも利用することができる。
Discrimination, accurate identification, and reliable techniques are required for accurate identification of Leishmania parasites. High-resolution melting (HRM) is recognized as an authentic and exact method. The main objective of this research was optimizing HRM analysis for detecting and screening Leishmania major, Leishmania tropica and mix infections. Thirty-six DNA samples of Leishmania parasite were prepared and analyzed. Two gene regions of amino acid permease 3 (AAP3) and cytochrome oxidase II (COII) were targeted and six pairs of specific new primers were designed. Bioinformatics analysis was employed to predict DNA temperature resolution for each species and compared with in-vitro results. The genetic diversity of the selected gene regions was analyzed using PCR-sequencing method and DnaSP 5.10.01 software. They were submitted in GenBank (KU680818- KU680821 and KY041643- KY041649). The haplotype diversity for both AAP3 and COII genes was 96% and 87%, respectively. Tajima's D index was 0.65 for AAP3 and 0.36 for COII. CLC Genomics Workbench 11 software predictions were significant and close to these findings. The designed primers could be able to identify at least two Leishmania species. Temperature variations in HRM technique separated Iranian Leishmania parasites of L. major, L. tropica and mix infections. The target genes and our modified HRM method proved this technique could be useful in both clinical and experimental settings. Also, it can be effective for detecting Leishmania parasites in different hosts such as humans, reservoir hosts and vectors. Indeed, HRM can be used as a technique in Leishmania identification as well as for ecological and epidemiological research.
Copyright © 2020. Published by Elsevier B.V.