アルジェリアから分離されたBacillus thuringiensis株の上清培養および胞子結晶混合物の毒性の評価

Evaluation of the Toxicity of Supernatant Cultures and Spore-Crystal Mixtures of Bacillus thuringiensis Strains Isolated from Algeria.

• Zahia Djenane
• Maria Lázaro-Berenguer
• Farida Nateche
• Juan Ferré

抄録

Bacillus thuringiensis（Bt）は、世界中で昆虫病原体の生物学的防除に最も利用されている技術である。昆虫抵抗性の出現に挑戦する新たなBt候補を選択するために、大量のバイオアッセイと分子スクリーニングを自己撞着性のコレクションで実施した。3 種類の鱗翅目（Mamestra brassicae、Grapholita molesta、Spodoptera exigua）の新生児幼虫に対する毒性試験を、鱗翅目に特異的な殺虫タンパク質をコードする少なくとも 1 つの遺伝子を持つ 49 個の Bt 単離株の胞子結晶混合物と上清培養物を用いて実施した。機能的死亡率」の30％の閾値を用いて、「無毒」と「毒性」の区別を行った。多くのBt単離株の毒性はBtk-HD1の毒性と競合した。しかし、そのうちの3つ（Bl4NA、Bl5NA、およびBl9NA）だけが、胞子結晶混合物および上清培養物の両方において、3つの鱗翅目種に対して高い毒性を示した。Bt単離Bl4NAとBl9NAは130kDaのタンパク質を発現しているのに対し、Bt単離Bl5NAは65〜70kDaのタンパク質を発現していた。ＬＣ-ＭＳ／ＭＳの結果から、Ｂｌ９ＮＡの１３０ｋＤａバンドの主要ペプチドはＣｒｙ１Ｄａ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａａであり、Ｂｌ５ＮＡの７０ｋＤａバンドの主要ペプチドはＣｒｙ１Ａａ、Ｃｒｙ１Ｃａであることが明らかになった。上清のタンパク質含有量をBtk-HD1と比較して評価したところ、これらの株ではVip3タンパク質が過剰に産生されていることがわかった（Bl4NAおよびBl9NAではVip3Aa、Bl5NAではVip3Caが最も多く産生されている）。さらに、これら3つのBt株はβ-エキソトキシンを産生していない。これらの結果から、これら3つの菌株は害虫防除に使用できる有望な候補株であると考えられる。

Bacillus thuringiensis (Bt) is the most used technology for biological control of insect pathogens worldwide. In order to select new Bt candidates challenging the emergence of insect's resistance, a mass bioassay and molecular screening was performed on an autochthonous collection. Toxicity assays against neonate larvae of three lepidopteran species (Mamestra brassicae, Grapholita molesta, and Spodoptera exigua) were conducted using spore-crystal mixtures and supernatant cultures of 49 Bt isolates harboring at least one gene coding for a lepidopteran-specific insecticidal protein. A threshold of 30% of "functional mortality" was used to discriminate between "nontoxic" and "toxic" isolates. The toxicity of many Bt isolates competed with that of Btk-HD1. However, only three of them (Bl4NA, Bl5NA, and Bl9NA) showed high toxicity in both spore-crystal mixtures and supernatant cultures against the three lepidopteran species. The Bt isolates Bl4NA and Bl9NA express a protein of 130 kDa whereas the Bt isolate Bl5NA expresses a protein of 65-70 kDa. The LC-MS/MS results indicate that the major peptides in the 130 kDa band of Bl9NA were Cry1Da, Cry1Ca, Cry1Ab, and Cry1Aa, and those in the 70 kDa band of Bl5NA were Cry1Aa and Cry1Ca. The evaluation of the protein content of the supernatants by comparison to Btk-HD1 indicates the overproduction of Vip3 proteins in these strains (most likely Vip3Aa in Bl4NA and Bl9NA and Vip3Ca in Bl5NA). In addition, these three Bt strains do not produce β-exotoxins. Based on our results, the three selected strains could be considered promising candidates to be used in insect pest control.