膵臓癌細胞のリン酸化プロテオーム解析によるキナーゼ阻害による放射線感受性の解明

Radiosensitization by kinase inhibition revealed by phosphoproteomic analysis of pancreatic cancer cells.

• Svenja Wiechmann
• Elena Saupp
• Daniela Schilling
• Stephanie Heinzlmeir
• Günter Schneider
• Roland M Schmid
• Stephanie E Combs
• Bernhard Kuster
• Sophie Dobiasch

抄録

膵管腺癌（PDAC）は最も侵攻性の高い癌の一つであり、その遺伝的不均一性の広さ、治療抵抗性の高さ、内在性の放射線感受性の高さなどで知られている。放射線抵抗性の根底にある分子機構を理解するために、我々は38のPDAC細胞株の電離放射線に対する表現型応答をスクリーニングした。その後、感受性株と耐性株の代表的な2つの細胞株についてリン酸化プロテオーム解析を行ったところ、7,800個のタンパク質と13,000個のリン酸化部位（p-サイト）が再現性を持って同定された。400個のタンパク質上の約700個のp-サイトは、表現型の感受性にかかわらず、すべての細胞株で放射線照射後に発現量の変化を示した。DNA損傷修復に関与するタンパク質のような既知の放射線応答性リン酸化マーカーを再現しただけでなく、タンパク質のリン酸化レベルでのみ明らかになっていた放射線応答性シグナル伝達ネットワークの新規メンバーが多数発見された。これらの制御されたp-サイトはATMの基質となりうるものに豊富に含まれており、in-vitroキナーゼアッセイによりそのうちの10個が確認された。放射線感受性細胞と放射線耐性細胞のプロテオームとリン酸化プロテオームを比較すると、アポトーシスタンパク質が関与している放射線耐性メカニズムがさらに存在することが示唆された。例えば、放射線抵抗性細胞におけるNADPHキニーネ酸化還元酵素1（NQO1）の発現の上昇は、有害な活性酸素種の除去を助けている可能性がある。耐性細胞はまた、アクチンダイナミクスや焦点接着キナーゼ（FAK）活性を含む細胞骨格組織に関与するタンパク質のリン酸化レベルの上昇を示し、1つの耐性細胞株は強い遊走表現型を示した。DefactinibによるFAKキナーゼの薬理学的阻害とRabusertibによるCHEK1の薬理学的阻害により、放射線抵抗性PDAC細胞において統計学的に有意な放射線感作が認められた。これらのデータは、放射線誘発シグナル伝達の包括的な分子ネットワークを示しており、放射線抵抗性の理解を深めるとともに、放射線治療戦略の開発の道筋を提供するものである。

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most aggressive cancers and known for its extensive genetic heterogeneity, high therapeutic resistance and strong variation in intrinsic radiosensitivity. In order to understand the molecular mechanisms underlying radioresistance, we screened the phenotypic response of 38 PDAC cell lines to ionizing radiation. Subsequent phosphoproteomic analysis of two representative sensitive and resistant lines led to the reproducible identification of 7,800 proteins and 13,000 phosphorylation sites (p-sites). Approximately 700 p-sites on 400 proteins showed abundance changes after radiation in all cell lines regardless of their phenotypic sensitivity. Apart from recapitulating known radiation response phosphorylation markers such as on proteins involved in DNA damage repair, the analysis uncovered many novel members of a radiation-responsive signaling network that was apparent only at the level of protein phosphorylation. These regulated p-sites were enriched in potential ATM substrates and in-vitro kinase assays corroborated 10 of these. Comparing the proteomes and phosphoproteomes of radiosensitive and -resistant cells pointed to additional tractable radioresistance mechanisms involving apoptotic proteins. For instance, elevated NADPH quinine oxidoreductase 1 (NQO1) expression in radioresistant cells may aid in clearing harmful reactive oxygen species. Resistant cells also showed elevated phosphorylation levels of proteins involved in cytoskeleton organization including actin dynamics and focal adhesion kinase (FAK) activity and one resistant cell line showed a strong migration phenotype. Pharmacological inhibition of the kinases FAK by Defactinib and of CHEK1 by Rabusertib showed a statistically significant sensitization to radiation in radioresistant PDAC cells. Together, the presented data map a comprehensive molecular network of radiation-induced signaling, improves the understanding of radioresistance and provides avenues for developing radiotherapeutic strategies.

Published under license by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.