アニオン性脂質がCRAF RBD-CRDのRAS結合部位へのアクセス性と膜結合親和性に影響を与える

Anionic Lipids Impact RAS-Binding Site Accessibility and Membrane Binding Affinity of CRAF RBD-CRD.

• Timothy Travers
• Cesar A López
• Constance Agamasu
• Jeevapani J Hettige
• Simon Messing
• Angel E García
• Andrew G Stephen
• S Gnanakaran

抄録

CRAFの活性化には、膜に固定された活性なGTP結合型RASとの結合が必要である。そのRAS結合ドメイン（RBD）は、RAS Gドメインへの主な結合インターフェースを含み、一方、そのシステインリッチドメイン（CRD）は、アニオン性脂質が豊富な膜への関連付けを担当している。両方のRAFドメインは短いリンカーによって接続されており、2つのドメインが独立して作用するのか、あるいは一方のドメインが他方のドメインの機能に影響を与えるのかは不明である。ここでは、粗視化と全原子分子動力学シミュレーションを組み合わせたCRAF RBD-CRD構築物を用いて、RBDがPOPC:POPSモデル膜に固定されたCRDに結合したときのRBDのダイナミクスを調べた。まず、RBDの位置は膜表面付近に優先的に局在しており、非常に動的であることを示しました。次に、膜に局在したRBDは、膜に近いためにRAS結合界面にはほとんどアクセスできないことを示しました。シミュレーションの結果、この界面に存在するいくつかの正に帯電した残基がRBDの膜への結合を促進するために重要であることが明らかになった。表面プラズモン共鳴(SPR)測定により、これらのRBD残基の変異はRBD-CRDのリポソーム分割を減少させることが確認されました。最後に、シミュレーションの結果、膜の近くにRBDが存在すると、アニオン性脂質が局所的に濃縮され、RBD-CRD全体の膜親和性が向上する可能性があることが示されました。このことは、SPR測定により、RBD-CRDのリポソーム分割がCRD単独よりも強いことが示されたことからも裏付けられています。CRDはRBDを膜に近づけ、RASへのアクセス性に影響を与え、RBDは局所的なアニオン性脂質の濃縮を引き起こし、膜とRBD-CRD間の全体的な親和性を高めています。これらのメカニズムは、膜におけるRASとCRAFの相互作用のイベントの順序に影響を与える可能性があります。

CRAF activation requires binding to membrane-anchored and active GTP-bound RAS. Whereas its RAS-binding domain (RBD) contains the main binding interface to the RAS G domain, its cysteine-rich domain (CRD) is responsible for association to anionic lipid-rich membranes. Both RAF domains are connected by a short linker, and it remains unclear if the two domains act independently or if one domain can impact the function of the other. Here, we used a combination of coarse-grained and all-atom molecular dynamics simulations of a CRAF RBD-CRD construct to investigate the dynamics of the RBD when it is tethered to CRD that is anchored to a POPC:POPS model membrane. First, we show that the RBD positioning is very dynamic with a preferential localization near the membrane surface. Next, we show that membrane-localized RBD has its RAS-binding interface mostly inaccessible because of its proximity to the membrane. Several positively charged residues in this interface were identified from simulations as important for driving RBD association to the membrane. Surface plasmon resonance (SPR) measurements confirmed that mutations of these RBD residues reduced the liposome partitioning of RBD-CRD. Last, simulations indicated that the presence of RBD near the membrane led to a local enrichment of anionic lipids that could potentially enhance the membrane affinity of the entire RBD-CRD construct. This was supported by SPR measurements that showed stronger liposome partitioning of RBD-CRD relative to CRD alone. These findings thus suggest that the RBD and CRD have synergistic effects on their membrane dynamics, with CRD bringing RBD closer to the membrane that impacts its accessibility to RAS and with RBD causing local anionic lipid enrichment that enhances the overall affinity between the membrane and RBD-CRD. These mechanisms have potential implications on the order of events of the interactions between RAS and CRAF at the membrane.

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