増幅不要の蛍光アッセイによる核酸の超高速検出と定量

Ultra-fast detection and quantification of nucleic acids by amplification-free fluorescence assay.

• Jesper Uhd
• Laura Miotke
• Hanlee P Ji
• Marina Dunaeva
• Ger J M Pruijn
• Christian Damsgaard Jørgensen
• Emil Laust Kristoffersen
• Victoria Birkedal
• Christina Westmose Yde
• Finn Cilius Nielsen
• Jonas Hansen
• Kira Astakhova

抄録

臨床的に重要な2種類の核酸バイオマーカーであるmicroRNA（miRNA）と循環腫瘍DNA（ctDNA）を、無増幅蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを用いてヒト血清から検出・定量した。具体的には、関節リウマチや癌に関連する変異BRAFとKRASのctDNAのうち、関節リウマチに関連するmiRNAであるhsa-miR-223-3pとhsa-miR-486-5pを直接測定した。アッセイに必要なオリゴヌクレオチドプローブは合理的に設計され、時間と費用対効果の高い新しい「クリック可能」なアプローチで合成されました。血清から核酸成分を単離する必要がなく、蛍光ベースのアッセイはわずか1時間で完了しました。標的の検出と絶対量の定量化に成功しました。得られたmiRNAとctDNAの量は、現在の技術と全体的に良好な相関を示した。適切なプローブを用いることで、我々の新しいアッセイ法とシグナルブースト法は、他の低アバンダンス核酸バイオマーカーをポイントオブケアで測定するための有用なツールとなる可能性がある。

Two types of clinically important nucleic acid biomarkers, microRNA (miRNA) and circulating tumor DNA (ctDNA) were detected and quantified from human serum using an amplification-free fluorescence hybridization assay. Specifically, miRNAs hsa-miR-223-3p and hsa-miR-486-5p with relevance for rheumatoid arthritis and cancer related mutations BRAF and KRAS of ctDNA were directly measured. The required oligonucleotide probes for the assay were rationally designed and synthesized through a novel "clickable" approach which is time and cost-effective. With no need for isolating nucleic acid components from serum, the fluoresence-based assay took only 1 hour. Detection and absolute quantification of targets was successfully achieved despite their notoriously low abundance, with a precision down to individual nucleotides. Obtained miRNA and ctDNA amounts showed overall a good correlation with current techniques. With appropriate probes, our novel assay and signal boosting approach could become a useful tool for point-of-care measuring other low abundance nucleic acid biomarkers.